糖腎方不同提取工藝治療糖尿病腎病的藥效學比較研究

張浩軍，趙婷婷，劉 鵬，嚴美花，趙海玲，孔 勤，張并璇，李 平

（中日友好醫院 臨床醫學研究所；北京市免疫炎性疾病重點實驗室，北京 100029）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）作為糖尿病嚴重的微血管并發癥，已成為我國慢性腎臟病的首位病因[1]。中醫藥治療DN特色與優勢明顯，本課題組在繼承名老中醫經驗基礎上研制了糖腎方，由黃芪、生地等7味中藥組成，具有益氣養陰，活血化瘀之功效，前期RCT臨床試驗和體內動物實驗均顯示其療效確切[2，3]。為了將其開發為安全有效、服用方便的中藥新藥，根據方中藥味成分理化性質及藥理活性，分別設計了3種提取工藝，利用單側腎切除合并STZ誘導的DN大鼠模型進行藥效學評價，以確定最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠 220只，雄性，體重為 180～220g，購自中國軍事醫學科學院實驗動物中心，動物合格證號：SCXK-（軍）2012-0004。

1.2 糖腎方提取供試樣品的制備

本方由黃芪、生地、大黃、三七、酒萸肉、鬼箭羽及枳殼7味藥組成，根據藥味所含成分理化性質、成分活性文獻報道及前期研究基礎，共設計以下三個提取工藝：

工藝1（傳統水提）：稱取處方量藥材，除三七粉碎成細粉外，其余六味藥加水提取2次，濃縮干燥，與三七粉混合過篩。

工藝2（醇提加水提）：稱取處方量藥材，酒萸肉、三七用60%乙醇提取2次，減壓濃縮；其余5味藥加水提取2次，濃縮，醇沉過濾，減壓濃縮，干燥后混合粉碎過篩。

工藝3（醇提加水提）：稱取處方量藥材，酒萸肉、三七、熟大黃用60%乙醇提取2次，減壓濃縮；其余4味藥加水提取2次，濃縮，醇沉過濾，減壓濃縮，干燥后混合粉碎過篩。

1.3 試劑與藥品

福辛普利鈉片（中美合資上海施貴寶制藥有限公司，10mg/片），鏈脲佐菌素（美國 Sigma-Aldrich公司），大鼠白蛋白測定試劑盒（美國Bethyl公司）。

1.4 實驗儀器

代謝籠（蘇州馮氏實驗動物設備有限公司）；倍易血糖儀（美國強生公司），CD-1600全自動生化分析儀（美國雅培公司），Model 680酶標儀（美國伯樂公司），BX-51光學顯微鏡及DP-70圖像采集系統（奧林巴斯公司）

1.5 動物造模

雄性Wistar大鼠，適應性喂養1周，進行基礎狀態測定，剔除血糖與尿蛋白異常的動物3只。其余大鼠以3ml/kg腹腔注射1%戊巴比妥麻醉，常規消毒，背部切口1～1.5cm，暴露右腎，剝離腎臟脂肪及腎上腺，結扎右腎門血管，切除右腎，縫合切口。術后動物恢復1周后，按40mg/kg腹腔注射1%的鏈脲佐菌素（用0.1mol/L的pH4.5的檸檬酸緩沖液配制），72h后尾尖采血測血糖，以高于16.7mmol/L為造模成功。

1.6 分組與給藥

造模成功大鼠165只，按血糖水平隨機分為11組，模型組，工藝1低、中、高劑量組（TSF1-L，TSF1-M，TSF1-H）、工藝2低、中、高劑量組（TSF2-L，TSF2-M，TSF2-H）、工藝 3 低、中、高劑量組（TSF3-L，TSF3-M，TSF3-H）（各工藝低、中、高劑量分別相當于糖腎方 2.5，5，10g 生藥/kg·d）和陽性藥對照組（2.0mg/kg·d福辛普利鈉），每組15只。另取15只未造模動物進行假手術，僅暴露右腎不做其它處理，1周后腹腔注射檸檬酸緩沖液，作為正常對照組。正常對照組和模型組動物給予同容積蒸餾水，連續給藥12周。

1.7 標本采集

造模后第0、4、8、12周，大鼠尾尖采血測血糖，同時將大鼠轉入代謝籠內，禁食給水，收集8h尿液。實驗結束時水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，分離血清，并摘取左腎，橫切后取中間部分固定于10%中性甲醛溶液進行組織病理學檢查。

1.8 指標檢測

一般狀態：動物每周稱體重，密切觀察動物精神狀態，反應性，毛發色澤，飲食及排泄狀況。

尿白蛋白：將各時間點收集的尿液以8000轉/分離心10min，吸取上清，按試劑盒說明書用ELISA法檢測尿白蛋白，用自動血生化分析儀測定尿肌酐；計算尿白蛋白/肌酐比值。

血生化指標：用強生OneTouch Ultra II穩豪血糖儀測定各時間點血糖值，血清樣本用全自動血生化分析儀測定血清總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、 肌酐（creatinine，Cre）、 谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、 谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）、總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。

組織病理學指標：腎組織用10%中性甲醛溶液固定24h后，乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚度3μm，進行PAS染色，光鏡下觀察腎組織病理學變化。

1.9 統計學方法

應用SPSS13.0軟件進行統計學分析，單變量方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結果

2.1 實驗組大鼠一般狀態及體重變化

從實驗開始，模型大鼠出現飲食飲水量增加，排尿增多，動物消瘦，毛色發黃，精神狀態變差，實驗期間動物死亡9只，其中TSF1-L死亡2只，TSF1-H死亡1只，TSF2-M死亡1只，TSF2-H死亡2只，TSF3-L死亡1只，TSF3-H死亡2只。與正常對照組比，模型組大鼠體重顯著降低，糖腎方3個工藝3個劑量均對模型大鼠體重無明顯影響（圖 1）。

2.2 實驗組大鼠血糖變化

造模后，模型組大鼠各個時間點血糖水平顯著高于正常對照組，糖腎方3個工藝各劑量組血糖水平與模型組大鼠相比無顯著性差異，表明糖腎方無明顯的降血糖作用（圖2）。

2.3 實驗組大鼠尿蛋白肌酐比值變化

與正常對照組比，模型組尿白蛋白肌酐比值顯著升高，TSF1-M和陽性對照藥顯著降低模型大鼠尿白蛋白肌酐比值，其余各給藥組與模型組比，尿白蛋白肌酐比值無統計學差異（圖3）。

2.4 實驗組大鼠腎功、TP及ALB變化

與正常對照組比，模型組大鼠血清BUN和Cre水平顯著升高，TP與ALB水平顯著降低。糖腎方3個工藝各劑量與陽性藥蒙諾對模型大鼠血清BUN水平無明顯影響，但顯著降低模型大鼠Cre水平。與模型組比，TSF1-M組血清ALB水平明顯升高，TSF2-M組TP水平顯著升高，其余各給藥組血清TP與ALB水平與模型組無顯著性差異（表 1）。

2.5 實驗組大鼠血脂及肝功變化

正常對照組與模型組血清T-CHO、LDL-C和AST水平無統計學差異，TG水平和HDL-C顯著降低，ALT水平顯著升高，與模型組比，TSF1-M，TSF2-L，TSF2-M及TSF3-L組血清HDL水平顯著升高，TSF2-M和TSF3-L血清T-CHO水平顯著升高，TSF1-M血清AST水平顯著升高，糖腎方3個工藝各劑量和陽性對照藥對模型大鼠血清TG、LDL-C和AST水平無顯著影響（表2）。

2.6 實驗組大鼠腎組織病理變化

正常對照組腎小球結構清晰，未見系膜基質增生，腎小管結構正常，排列整齊，模型組腎臟明顯增大，腎小球內系膜基質中度增生，部分區域出現局灶性腎小球硬化，腎小管上皮細胞呈現玻璃滴樣病變和空泡變性，部分區域出現腎小管擴張、萎縮及壞死。間質散在淋巴細胞和單核細胞浸潤及纖維化，TSF1-M組和陽性藥對照組腎小球及小管間質病變與模型組比明顯改善，TSF1-L組與TSL1-H組腎小球系膜輕度增生，腎小管部分區域有擴張，個別區域有壞死，TSF2-L組、TSF2-M組、TSF2-H組腎組織病變程度在正常對照組和模型組之間，TSF3-L、TSF3-M、TSF3-H組腎小球系膜基質增生程度與模型組相比無明顯改善，且TSF3-M、TSF3-H組腎小管間質損害如炎細胞浸潤、小管擴張程度較模型比更為嚴重（圖4，見封底）

表1 糖腎方不同提取工藝對腎功、TP和ALB的影響

表2 糖腎方不同提取工藝對血脂及肝功的影響

3 討論

糖腎方作為本課題組研制的治療DN中藥復方，多中心RCT臨床試驗和動物實驗的研究中已證實了其療效[2，3]。然而，在開展了成藥性研究中發現：采用傳統水提工藝的糖腎方出膏率較高，在制劑和毒理研究中也會存在服用量大、給藥困難等問題。文獻研究發現，黃芪、生地、山茱萸中的多糖類成分是本方出膏率高的主要因素，而三七總皂苷和山茱萸的環烯醚萜總苷改善DN作用明顯[4，5]，大黃中的蒽醌類成分如大黃酸等對DN具有腎保護作用[6]，但該類成分也存在肝腎毒性等問題[7]，上述成分醇提溶出率高，且可降低出膏率。因此在工藝研究中設計了部分藥味醇提的2種工藝，并與水提工藝進行藥效比較，以期獲得最佳提取工藝。

DN研究中由于糖尿病引起模型動物腎損害較為緩和，且病程較長，單側腎切除可加速DN病程及加重腎臟病理改變[8]，是一種較為理想的DN藥效學評價模型。本研究利用單側腎切合并STZ注射誘導大鼠高血糖12周后，尿白蛋白肌酐比值較正常對照組升高了約20倍，出現腎小球系膜基質增生、腎小管擴張、萎縮及間質纖維化等病理改變，表明模型建立成功。在此基礎上進行了糖腎方不同提取工藝的藥效學比較。結果表明工藝1中劑量在降低尿白蛋白排泄和改善腎病理損傷效果最為顯著，且顯著升高模型大鼠血清HDL-C水平，提示其也有改善脂代謝異常的作用。而高劑量組藥效較差，未顯示量效相關性。一方面可能由于高劑量糖腎方給藥量過大，影響了大鼠食欲與狀態，另一方面其ALT顯著升高，提示高劑量的工藝1可能損傷了肝功能，引起藥物代謝動力學改變，影響藥效發揮。工藝2對尿白蛋白和腎損害也表現出改善的趨勢，但不及工藝1。有報道黃芪多糖和地黃多糖具有減輕DN的活性[9，10]，黃芪中的皂苷[11]、地黃中的梓醇[12]以及枳殼中的柚皮苷[13]、橙皮苷[14]對DN也有腎保護作用，醇沉工藝除去了大部分多糖，也引起上述成分含量降低，可能與其藥效降低有關。研究還發現工藝3甚至還有加重腎損傷的趨勢，這可能與大黃醇提后蒽醌類溶出增加，后者引起腎毒性所致[15]。

綜上所述，采用傳統水提的工藝1，在改善DN模型大鼠腎組織病理損害、減少尿白蛋白排泄方面藥效顯著優于工藝2和工藝3，為最佳提取工藝，因此，下一步研究將以水提工藝為基礎，對其不同組分進行藥效學評價，為將其開發為藥效成分明確、質量可控、安全有效的中藥新藥奠定基礎。

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