內源乳化法制備干酪乳桿菌微膠囊

（東北農業大學食品學院乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

內源乳化法制備干酪乳桿菌微膠囊

張國芳，王婷婷，劉麗波，趙麗雙，呂秋月，張碩，王婧瑩，李春

（東北農業大學食品學院乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

為提高益生菌干酪乳桿菌KLDS 1.0301對不利環境的抗性，采用內源乳化法，將菌株包埋在海藻酸鈉和濃縮乳清蛋白中制成微膠囊制劑。通過響應面實驗對微膠囊包埋工藝參數進行優化，并通過人工胃腸液對微膠囊的耐受性進行分析。結果表明，微膠囊的最佳制備工藝：海藻酸鈉1.93%，海藻酸鈉與濃縮乳清蛋白80的質量比1∶1，水油體積比1∶2.7，碳酸鈣與海藻酸鈉質量比1∶2.18，包埋率為93.51%。干酪乳桿菌微膠囊在模擬人工胃液中處理3 h后活菌數下降2個對數值，而未經包埋的干酪乳桿菌在相同條件下活菌數下降4個對數值。干酪乳桿菌微膠囊在人工腸液中處理60 min后，活菌數基本保持不變，表明了干酪乳桿菌微膠囊具有較好的腸溶性。將包埋的微膠囊與嗜熱鏈球菌KLDS 3.0501和保加利亞亞種ATCC 11842在乳清粉底料中進行混合發酵，發現包埋的干酪乳桿菌在發酵期間同樣能夠良好產酸，并對產酸量幾乎沒有影響。

干酪乳桿菌；內源乳化法；微膠囊；胃腸道；應用

0 引言

益生菌作為食品領域的重要微生物，其高效的價值是不容小覷的。但在實際應用中，無論是在加工儲藏，還是在人體胃腸道的過程中都會對益生菌的活性和數量有一定不良影響。因此，有效的保護益生菌以抵抗外界的不利環境因素是非常重要的[1-3]。利用微膠囊包埋技術可以增強菌體對消化道內環境的耐受性和抵抗力，能夠顯著地提高菌體的生存能力。微膠囊化的方法有很多種，但能夠高效包埋益生菌的方法還在探索中[4]。目前，內源乳化法應用比較廣泛，該法具有工藝流程簡單，便于工業化生產，微膠囊粒徑大小可控，安全可食用等優點[5-7]。

本研究利用內源乳化法制備干酪乳桿菌微膠囊，運用響應面法探究其最佳的包埋工藝，并對微膠囊的保護作用進行評價。

1 實驗

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗菌種

干酪乳桿菌KLDS 1.0301，嗜熱鏈球菌KLDS 3.0501，來源于乳品科學教育部重點實驗室（KLDS）；德氏乳桿菌保加利亞亞種ATCC 11842，來源于美國模式菌種收集中心。

1.1.2 試劑

胃蛋白酶（活力453U/mg），胰蛋白酶（活力11800U/mg），磷酸氫二鈉，冰醋酸，磷酸氫二鉀，氯化鈉，海藻酸鈉，檸檬酸鈉，丙三醇，碳酸鈣，大豆油，Span-80，乙醇，濃縮乳清蛋白80，MRS培養基，M17肉湯培養基。

1.1.3 儀器與設備

PL2002型電子天平，PL203型電子分析天平，Del?ta320型pH計，HJ-3磁力恒溫攪拌器，SPX-150B生化培養箱，上海一恒有限公司；QT-1型旋渦混合器，TGL-16G型高速離心機離心機，HIRAYAMA HVE-50型高壓滅菌器，手動移液器。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

將干酪乳桿菌菌粉按體積分數為2%的接種量接種于MRS液體培養基中，于恒溫培養箱中37℃培養20 h，活化2～3次后，離心（4 000 r/min，4℃，離心15 min），收集菌體并用質量分數為0.9%無菌生理鹽水洗滌2遍，同樣條件離心得到菌體，然后用無菌生理鹽水將菌體配置成一定濃度的菌懸液。

1.2.2 主要溶液的配置

解囊液：分別配制濃度為0.1 mol/L的磷酸氫二鈉和濃度為0.05 mol/L的檸檬酸，調節pH=7.25，121℃滅菌15 min待用。

模擬人工胃液[8]：取濃度為0.1 mol/L稀鹽酸溶液16.4 mL，胃蛋白酶10 g，加無菌水攪拌均勻后，定容至1 L，調節pH=1.2，過0.22 μm微孔濾膜除菌備用。

模擬人工腸液[8]：稱取磷酸二氫鉀6.8 g，胰蛋白酶10 g，加適量無菌水使之溶解，定容至1 L，調節pH= 7.4，過0.22 μm微孔濾膜除菌備用。

1.2.3 內源乳化法制備干酪乳桿菌微膠囊工藝流程

內源乳化法制備微膠囊的過程參照Chandramouli[9]等人報道的方法，并在此基礎上進行修改。將10 mL菌懸液與20 mL一定濃度的海藻酸鈉和濃縮乳清蛋白溶液混合均勻后，加入碳酸鈣粉末，均勻地分散到該混合溶液中，然后再將此混合液乳化到含有體積分數1.0%的Span80大豆油中（轉速為300 r/min），15 min后，加入冰醋酸繼續攪拌，以促進冰醋酸和碳酸鈣的接觸反應，30 min后，向該體系加入pH=5.5的醋酸鹽溶液并緩慢攪拌，待凝膠成型的微膠囊都沉降到醋酸鹽溶液底部后，吸去油相，收集微膠囊，洗滌2次,去除剩余油相和表面菌體。最后將收集到的微膠囊存放于質量濃度為0.2 g/100 mL的氯化鈉中，放在4℃冰箱保存。

1.2.4 微膠囊包埋工藝單因素實驗

以微膠囊的包埋率為指標，通過單因素試驗測定不同海藻酸鈉質量分數（1%，2%，3%，4%，5%）；大豆油的體積（30，90，150，210，240 mL）；濃縮乳清蛋白（海藻酸鈉與濃縮乳清蛋白的質量比分別為5∶1，3∶1，1∶1，1∶3，1∶5）；碳酸鈣（碳酸鈣與海藻酸鈉的質量比分別為1∶1，1∶1.5，1∶3，1∶6，1∶15）對微膠囊包埋效果的影響。

1.2.5 響應面法優化干酪乳桿菌微膠囊包埋工藝

選取海藻酸鈉（A）、濃縮乳清蛋白（B）、水油體積比（C）和碳酸鈣（D）四個因素，以微膠囊的包埋率為響應值，設計四因素三水平的響應面優化試驗,確定干酪乳桿菌微膠囊的最佳包埋工藝（表1）。

表1 干酪乳桿菌微膠囊制備工藝響應面實驗因素水平

1.2.6 干酪乳桿菌微膠囊耐受性[10]

1.2.6.1 干酪乳桿菌微膠囊在人工胃液中的耐受性測試

實驗組：取1 g干酪乳桿菌微膠囊加入裝有99 mL人工胃液的三角瓶中，于37℃搖床中震蕩處理0.5，1，1.5，2，2.5 h；分別取樣，活菌計數。另取1mL菌懸液作對照。

1.2.6.2 干酪乳桿菌微膠囊在人工腸液中的耐受性測試

取1 g干酪乳桿菌微膠囊加入裝有99 mL人工腸液的三角瓶中，于37℃搖床中震蕩處理0，0.5，1，1.5，2 h；分別取樣，進行活菌計數，測定其溶出情況。

1.2.7 干酪乳桿菌微膠囊的應用

（1）干酪乳桿菌微膠囊產品儲藏穩定性。實驗組：將最佳工藝條件下包埋的干酪乳桿菌微膠囊置于4℃條件下進行保藏，每隔7 d取樣計活菌數，檢測微膠囊的穩定性。對照組：相同條件下取未被包埋的干酪乳桿菌置于4℃條件下進行保藏，每隔7 d取樣計活菌數。

（2）干酪乳桿菌微膠囊在乳清粉中的發酵產酸分析。實驗組：以干酪乳桿菌微膠囊、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌為試驗菌株，將活化后的三種菌株按體積比為1∶1∶1接種于乳清粉培養基中，于37℃恒溫培養箱中培養24 h。每隔3 h取樣，測定試樣的PH值和每種菌株的活菌數。對照組：相同條件下，以干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌為試驗菌株，測定試樣的pH值和每種菌株的活菌數。

1.3 分析方法

菌落計數采用國標GB 4789.35-2010中MRS固體培養基平板傾注法[11]。

pH值采用S-25型酸度計測定，每試樣重復3次。

包埋率[12]：稱取0.1 g微膠囊產品，加入到20 mL解囊液中，在恒溫搖床培養箱中以37℃,180 rpm的條件進行崩解。取1 mL樣品稀釋后釆用傾注法倒平板，置于37℃培養箱培養48 h，菌落計數，得微膠囊中包埋的活菌數。

1.4 統計學處理

利用SPSS 17.0統計分析軟件進行分析處理，每個實驗重復3次，結果用3次獨立試驗均值±標準差形式表示表示，采用one-way ANOVA檢驗比較不同組間差別，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 海藻酸鈉質量分數對微膠囊包埋率的影響

圖1為海藻酸鈉質量分數對微膠囊包埋率的影響。由圖1可以看出，微膠囊的包埋率隨海藻酸鈉質量分數的增大而升高，當海藻酸鈉質量分數為2%時，微膠囊的包埋率最大，當海藻酸鈉的濃度繼續變大時，微膠囊的包埋率反而降低了。其原因可能是：海藻酸鈉濃度較高時，黏度變大，不利于菌體均勻的分散，形成的囊壁過厚。海藻酸鈉的質量分數較低時，形成的膜過薄，機械強度不好，影響包埋效果。

圖1 海藻酸鈉質量分數對微膠囊包埋率的影響

2.2 濃縮乳清蛋白質量分數對微膠囊包埋率的影響

圖2為濃縮乳清蛋白質量分數對微膠囊包埋率的影響。由圖2可以看出，微膠囊的包埋率隨海藻酸鈉與乳清蛋白的質量比的降低而升高，當海藻酸鈉與濃縮乳清蛋白的質量比為1∶1時，微膠囊的包埋率最高。

圖2 濃縮乳清蛋白質量分數對微膠囊包埋率的影響

2.3 水油體積比對微膠囊包埋率的影響

圖3為大豆油的添加量比對微膠囊包埋率的影響。由圖3可以看出，油相不足時，可能導致微球粘連，包埋率較低。水油體積比變大時，分散空間比較寬松，有利于大液滴的形成，但微膠囊的粒徑要求不要過大。當水油體積比為1∶3時，微膠囊的包埋率最高。

2.4 碳酸鈣濃度對微膠囊包埋率的影響

圖3 大豆油的添加量比對微膠囊包埋率的影響

圖4為碳酸鈣的添加量對微膠囊包埋率的影響。由圖4可以看出，當碳酸鈣與海藻酸鈉的質量比為1∶3時，微膠囊的包埋率最高，為92.86%。當溶液中的Ca2+濃度比較低的時候，外層的海藻酸鈣沉淀不容易形成。但當碳酸鈣的加入量變大時，會使溶液的表面張力面大，密度增加，導致微膠囊的包埋率降低。

圖4 碳酸鈣的添加量對微膠囊包埋率的影響

2.5 干酪乳桿菌微膠囊工藝優化

響應面實驗結果如表2所示。

2.5.1 回歸模型的確定和顯著性分析

利用Design-expert軟件對響應值進行處理，表為回歸模型方差分析結果。

利用軟件建立二次多元回歸方程：Y=92.86000+ 0.39083A+0.26167B-0.488833C-2.26417D+0.26000AB-0.82750AC+3.05500AD-1.57500BC+0.4500BD+1.58750 CD-8.87875A2-9.80750B2-4.82250C2-2.42125D2

從回歸分析以及方差分析表可以看出該模型的擬合效果比較好，說明試驗的可信度和精確度較高。

2.5.2 模型驗證

通過軟件分析，微膠囊的最佳制備工藝如圖5所示：海藻酸鈉1.93%，海藻酸鈉與乳清蛋白質量比1∶1，水油體積比1∶2.7，碳酸鈣與海藻酸鈉質量比1∶2.18。以此條件進行驗證實驗。三次試驗的平均包埋率為92.5%，基本與模型的預測值93.51%是相符的，說明響應面優化試驗得到的數學模型與試驗的具體數據的擬合效果很好，可以用于干酪乳桿菌微膠囊的包埋。圖6為各因素兩兩交互作用對包埋率的影響。

圖5 干酪乳桿菌微膠囊包埋工藝最優參數

表2 響應面優化實驗結果

圖6 因素間交互作用

2.6 干酪乳桿菌微膠囊在模擬人工胃液中的耐受性

圖7為干酪乳桿菌微膠囊在模擬胃液中的活菌數變化結果。由圖7可以看出，干酪乳桿菌經模擬胃液處理90 min后，活菌數從8.81 mL-1(對數值)下降到4.30 mL-1(對數值)，下降4個對數值，150 min后幾乎剩余較少了，這是由于干酪乳桿菌的耐胃酸能力很差，胃酸的低PH值會導致存活率的降低。干酪乳桿菌微膠囊在模擬胃液中處理90 min后，活菌數從8.78 mL-1(對數值)下降到6.64 mL-1(對數值)，下降2個對數值，120 min后，仍有5.20 mL-1(對數值)的菌體存活，相比于未經包埋的干酪乳桿菌，微膠囊化顯著的提高了菌株在模擬胃液中的存活量。實驗結果表明：采用內源乳化法制備的干酪乳桿菌微膠囊能夠抵抗較低pH值的影響，保證經胃酸的作用后仍有足夠數量的活菌到達腸道內定制并發揮益生所用。

圖7 干酪乳桿菌微膠囊在模擬胃液中的活菌數變化

2.7 干酪乳桿菌微膠囊在模擬人工腸液中的耐受性

圖8為干酪乳桿菌微膠囊在模擬腸液中的活菌數變化。由圖8可以看出，干酪乳桿菌微膠囊經模擬腸液處理60 min后，干酪乳桿菌的活菌數保持不變，維持在8.0 mL-1(對數值)，說明本研究所制備的微膠囊具有很好的腸溶性，60 min后，能將包埋在微膠囊內部的活菌都釋放出來。

圖8 干酪乳桿菌微膠囊在模擬腸液中的活菌數變化

2.8 干酪乳桿菌微膠囊產品儲藏穩定性

圖9為未包埋與包埋的干酪乳桿菌微膠囊在4℃的儲藏穩定性。由圖9可以看出，兩種樣品中的活菌數都隨著儲藏時間的增加而處于下降的趨勢。未經過微膠囊化包埋的干酪乳桿菌的活菌數從8.9 mL-1(對數值)下降到3.0 mL-1(對數值)，下降了6個數量級。利用微膠囊技術保護的干酪乳桿菌，活菌數從8.87 mL-1(對數值)下降到了4.78 mL-1(對數值)，下降了4個數量級，說明微膠囊能夠顯著提高干酪乳桿菌的儲藏穩定性。

圖9 干酪乳桿菌微膠囊在4℃的儲藏穩定性

2.9 干酪乳桿菌微膠囊在乳清粉中的發酵分析

2.9.1 復合菌種發酵過程活菌數的變化

圖10為復合菌種在乳清粉中混合發酵活菌數變化結果。由圖10可以看出，干酪乳桿菌在包埋之后，雖然發酵過程中產酸比較慢，開始時的活菌數變化不明顯，但15 h左右可以被完全釋放出來，能保持較高的活菌數。

2.9.2 復合菌種發酵過程pH值變化

圖10 復合菌種在乳清粉中混合發酵活菌數變化

圖11為復合菌種發酵的pH值隨時間變化的曲線。由圖11可以看出，復合菌種在發酵的過程中，pH值呈降低趨勢，pH值由6.5降至4.3。兩種樣品在發酵12 h前未包埋的菌株pH值變化的更明顯，包埋的菌株pH值變化比較慢，但發酵終點的pH值相差不大。結果表明，微膠囊化的干酪乳桿菌在發酵過程中雖然釋放的比較緩慢，但是并不影響發酵終點時發酵乳的酸度。進而表明微膠囊化的干酪乳桿菌不僅得到了保護，在應用時也能被完全的釋放出來。

圖11 復合菌種發酵的pH值隨時間變化的曲線

3 結論

采用內源乳化法制備的干酪乳桿菌1.0301微膠囊的最佳包埋工藝條件為海藻酸鈉1.93%，海藻酸鈉與乳清蛋白質量比1∶1，水油體積比1∶2.7，碳酸鈣與海藻酸鈉質量比1∶2.18，此條件下所形成的微膠囊的包埋率為93.51%。所制備的干酪乳桿菌微膠囊在人工胃液中處理3 h活菌數下降2個對數值，在模擬人工腸液中60 min后可以被完全釋放，放在4℃下45 d仍有較高的存活率。

由此可以證明，試驗所制備的微膠囊在模擬胃腸液中具有較好的耐受性和較高的儲藏穩定性，且微膠囊在復合菌株發酵過程表現較好的產酸性。為該菌種在功能性食品方面的應用提供理論基礎。

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Internal emulsification microcapsule preparation of Lactobacillus casei

ZHANG Guofang,WANG Tingting,LIU Libo,ZHAO Lishuang,LYU Qiuyue,ZHANG Shuo, WANG Jingying,LI Chun
(Key Laboratotry of Dairy Science，Ministry of Education,College of Food Science,Northeast Agricultural University, Harbin 150030,China)

To improve the probioticLactobacillus caseiKLDS 1.0301 resistance to adverse environment,the internal emulsification method is adopted,the strain of the embedding in the sodium alginate and whey protein in composite wall made of microcapsule preparation.Through the response surface optimization experiment optimize the microcapsule embedding process parameters,and through the artificial stomach in?testinal juice tolerance analysis of microcapsules.Experimental results show that the best preparation technology of microcapsule are as fol?lows:sodium alginate 1.93%,sodium alginate and whey protein concentrate 80 ratio 1∶1,the quality of water and oil volume ratio 1∶2.7,cal?cium carbonate and sodium alginate mass ratio of 1∶2.18,the embedding rate was 93.51%.Lactobacillus casei microcapsules in simulated in artificial gastric juice processing 3 h after the number of living bacterium down two of value,and without the embedding ofLactobacillus casei under the condition of same number of living bacterium fell four to numerical values.Lactobacillus caseimicrocapsules in the artificial intestinal juice processing,after 60 min basic remains the same number of living bacterium,showed that lactobacillus casei microcapsule has good intes?tinal soluble.The embedding of the microcapsules withThermophilic streptococcusKLDS 3.0501 andBulgaria SubspeciesATCC 11842 in the base of whey powder mixed fermentation,found that the embedding ofLactobacillus caseigood can also produce acid during fermentation,and have little impact on produce acid.

lactobacillus casei;internal emulsification method;microcapsules;the gastrointestinal tract;application;

TS201.3

：A

：1001-2230（2017）03-0015-06

2016-09-20

國家自然科學基金（31671874）。

張國芳（1990-），女，碩士研究生，從事乳品科學方面的研究。

劉麗波