HBV相關肝細胞癌腫瘤組織中熱休克蛋白mRNA表達水平與腫瘤分期的相關性分析

徐慶年， 陸云飛， 湯伯宗， 陳曉蓉， 楊宗國

(上海市公共衛生臨床中心， 上海 201508)

HBV相關肝細胞癌腫瘤組織中熱休克蛋白mRNA表達水平與腫瘤分期的相關性分析

徐慶年， 陸云飛， 湯伯宗， 陳曉蓉， 楊宗國

(上海市公共衛生臨床中心， 上海 201508)

目的 分析肝細胞癌(HCC)腫瘤組織中熱休克蛋白(HSP)mRNA表達水平與HCC腫瘤分期的相關性。方法 從NCBI網站的基因表達數據庫(GEO)下載GSE14520數據集。從GSE14520基因數據庫中獲取HSP基因25種，通過與數據庫下載的臨床資料比對，納入具有HSP基因 mRNA表達水平和有對應臨床資料的220例HCC患者。提取220例患者癌組織HSP基因的mRNA表達水平及對應的TNM分期及BCLC分期并進行相關性分析。采用Kruskal-WallisH非參數檢驗進行多組間比較，采用單因素及多因素logistic回歸分析HSP與HCC腫瘤分期的相關性。結果 HSPA12A、HSPA5、HSP90AA1與HSPA13 mRNA隨著TNM分期增高，表達逐漸升高(P值均<0.05)；HSP90AA1 mRNA隨著BCLC分期增高，表達逐漸升高(P<0.05)。HSPA4L(OR=1.019，P=0.005)、HSPA12A(OR=1.077，P=0.026)與HSP90AA1(OR=1.001，P=0.002)是影響TNM分期的危險因素；HSPA9 mRNA升高與HCC患者TNM分期呈負相關(OR=0.995，P=0.011)。HSPH1(OR=1.005，P=0.041)、HSPA1B(OR=1.002，P=0.048)與HSPA5(OR=1.000，P=0.001)是影響BCLC分期的危險因素；HSPA9 mRNA升高與肝癌BCLC分期呈負相關(OR=0.995，P=0.005)。結論 HSP與HCC患者腫瘤臨床分期存在一定相關性。

熱休克蛋白質類； 癌, 肝細胞； 腫瘤分期； 回歸分析

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)作為分子伴侶在細胞的生長發育、代謝分化、基因轉錄、維持組織細胞的自穩和環境適應性方面發揮重要作用。研究發現腫瘤細胞的增殖、分化及轉移均有大量的HSP參與，表明HSP與細胞的轉化和惡變過程密切相關[1-2]。筆者前期研究結果發現，肝細胞癌(HCC)是HSP70和HSP90α高表達的腫瘤，細胞內HSP70和HSP90α表達增加與腫瘤發生、發展、預后有關，可能是HCC發展惡化的重要標志[2-3]。隨著HSP與HCC相互關系研究的不斷深入，HSP在HCC生物治療中將發揮越來越重要的作用。HCC腫瘤臨床分期與其治療選擇和預后密切相關[4]，本研究利用基因表達數據庫(gene expression omnibus, GEO)中GSE14520基因表達樣本，對腫瘤組織中HSP mRNA表達水平與HCC腫瘤臨床分期進行分析，評價二者的相關性。

1 材料與方法

1.1 公共數據庫資料獲取 從NCBI網站的GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載GSE14520數據集。GSE14520包含2個芯片平臺，分別是Affymetrix HT Human Genome U133A Array (GPL3921)和Affymetrix HT Human Genome U133A 2.0 Array (GPL571)。應用GPL3921和GPL571平臺檢測HCC組織的病例數分別為220例和22例。RNA樣品經過生物素標記與芯片雜交，采用GeneChip scanner 3000掃描，應用GCOS1.0軟件進行初步分析。

1.2 研究對象 242例HCC患者的肝癌組織及配對的癌旁組織均來自于復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所，所有患者均具有慢性HBV感染史或乙型肝炎肝硬化史。HCC診斷由2位病理學醫師根據臨床信息及病理學特征獨立完成。用TRIzol提取肝癌及癌旁組織的總mRNA，質檢合格后用于上述芯片的檢測[5]。1.3 HSP篩選及臨床資料匹配 從GSE14520基因數據庫中獲取HSP基因25種，通過與數據庫下載的臨床資料比對，22例樣本因無對應的臨床資料被剔除，最終納入具有HSP基因的mRNA表達水平和有對應臨床資料的220例HCC患者。提取220例患者癌組織HSP基因的mRNA表達水平，及對應的TNM分期及BCLC分期進行相關性分析。TNM分期根據國際抗癌聯盟2002年發布的標準[6]，BCLC分期根據1999年Llovet等報道的標準[7]。

2 結果

2.1 不同TNM分期HCC患者腫瘤組織中HSP mRNA表達水平 在HCC患者中，腫瘤組織HSPA12A、HSPA2、HSPA5、HSP90AA1、HSPA13和HSPA14 mRNA表達在不同TNM分期間存在差異(P值均<0.05)，其中HSPA12A、HSPA5、HSP90AA1與HSPA13 mRNA隨著TNM分期增高，表達逐漸升高(表1)。2.2 不同BCLC分期HCC患者腫瘤組織中HSP mRNA表達水平 HCC患者中，HSPA4L、HSPA5、HSP90AA1與HSPA14 mRNA表達在不同BCLC分期間存在差異(P值均<0.05)，其中HSP90AA1 mRNA表達水平隨著BCLC分期增高，表達逐漸升高(表2)。

2.3 HSP mRNA表達水平對HBV-HCC患者TNM分期的影響 將HCC腫瘤TNM分期轉化為二分類變量，TNM Ⅰ～Ⅱ期與TNM Ⅲ期。logistic單因素分析顯示，腫瘤組織中HSPH1、HSPA4L、HSPA12A、HSPA5、HSPA9及HSP90AA1可能與HCC患者TNM分期有關(P值均<0.10)；將上述HSP利用Forward LR法納入logistic多因素分析，結果顯示，HSPA4L(OR=1.019，P=0.005)、HSPA12A(OR=1.077，P=0.026)與HSP90AA1(OR=1.001，P=0.002)是影響TNM分期的危險因素；HSPA9升高與HCC患者TNM分期呈負相關(OR=0.995，P=0.011)(表3)。

2.4 HSP mRNA表達水平對HBV-HCC患者BCLC分期的影響 將HCC腫瘤BCLC分期轉化為二分類變量，肝癌早期(BCLC 0～A期)與肝癌中晚期(BCLC B～C期)。logistic單因素分析顯示，腫瘤組織中HSPH1、HSPA4L、HSPA1A、HSPA1B、HSPA5、HSPA9及HSP90AA1可能與HCC患者BCLC分期有關(P值均<0.10)；將上述HSP利用Forward LR法納入logistic多因素分析，結果顯示，HSPH1(OR=1.005，P=0.041)、HSPA1B(OR=1.002，P=0.048)與HSPA5(OR=1.000，P=0.001)是影響BCLC分期的危險因素；HSPA9升高與肝癌BCLC分期呈負相關(OR=0.995，P=0.005)(表4)。

表1 不同TNM分期HBV-HCC患者HSP mRNA表達水平比較

3 討論

已有大量研究證實，腫瘤細胞的增殖、分化及轉移等過程均有大量的HSP參與[8-10]。HSP能與多種癌基因產物結合形成異源性蛋白復合體，介導癌蛋白構象成熟及轉運，從而參與細胞轉化過程。其中HSP70是HSP中最保守、最重要的一族，在大多數生物中含量最多，在應激反應中最敏感，因而是HSP中最受關注、研究最深入的一種[2,11]。另外，HSP90家族與腫瘤關系密切，在一些癌基因及其產物誘發的轉化細胞和許多腫瘤細胞中HSP90表達增高[12-13]。HSP70和HSP90在HCC中高表達，參與腫瘤細胞的增生與凋亡，與肝癌的發生發展、生物學行為及預后有著密切的關系[2-3,11]。

本研究發現，腫瘤組織中HSP70家族(HSPA12A、HSPA5與HSPA13)在HCC患者不同TNM分期中存在表達差異，且隨著TNM分期增高，表達逐漸升高。HSP70作為分子伴侶參與腫瘤細胞的功能代謝，保護腫瘤細胞免受有害因素的影響。HSP70在腫瘤細胞異于正常細胞的定位分布，在某種程度上反映了細胞生物學行為的異常。通過logistic回歸進一步分析發現，HSP70家族中HSPA4L、HSPA12A、HSPA1B及HSPA5表達水平升高是腫瘤TNM分期或BCLC分期升高的危險因子。筆者的前期研究[2-3]發現，HSP70表達與HCC臨床病理學特征存在一定的相關性，并對腫瘤增生及多發結節等因素具有一定的預測價值，可能為HCC治療靶點及預后預測因子。另有學者[14-15]認為，HCC中HSP70表達隨著組織學分級增高而增高，在HBV相關的HCC中有HSP70的過度表達和自發性細胞凋亡，癌細胞分化程度越低，惡性程度越高，HSP70表達水平越高，細胞凋亡越明顯，因而HSP70可能為肝癌細胞惡性程度和預后的重要指標。

表2 不同BCLC分期HBV-HCC患者HSP mRNA表達水平比較

表3 HSP mRNA表達水平對HBV-HCC患者TNM分期的影響

表4 HSP mRNA表達水平對HBV-HCC患者BCLC分期的影響

根據是否含有谷氨酰胺的片段，HSP90可分為HSP90α(HSP90AA1)和HSP90β兩種，兩者同源性高達84%。在病毒轉化和化學誘導的腫瘤細胞中，HSP90α表達水平明顯升高，而HSP90β基本不變[12]。多項研究[16-17]表明，HSP90α在肝癌患者血漿及血清中的表達明顯高于健康對照者。而免疫組化同樣發現HSP90α在肝癌組織中表達明顯高于癌旁組織[18]。本研究的分析發現，腫瘤組織中HSP90α在HCC患者不同TNM分期及BCLC分期中存在表達差異，且隨著TNM分期及BCLC分期增高，其表達逐漸升高。通過logistic回歸進一步分析HSP90α與HCC腫瘤分期的關系，結果發現，HSP90α升高一定程度上提示HCC患者TNM分期較高。研究表明，HSP90α可促進細胞遷移并通過調節細胞周期促進細胞增殖。腫瘤細胞尤其依賴HSP90α生存于氧含量低、營養缺乏的微環境，HSP90α可作為一種正向調節因子參與血管再生[19-21]。HSP90α是肝癌組織轉移的重要基因[20]，與本研究中HSP90α與HCC患者TNM分期有相關性的結果是一致的。原發性肝癌患者血清HSP90α與肝癌腫瘤分化程度、腫瘤大小顯著相關，HSP90α陰性患者預后顯著優于HSP90α陽性患者，術后平均無瘤生存期前者38.6個月、后者25.5個月(P<0.05)，提示HSP90α可作為判斷原發性肝癌的臨床分期及預后的指標[17,22]。另外，由于HSP90α在維持多種腫瘤蛋白的正常結構、功能和穩定性中的重要作用，它已被認為是腫瘤治療的新靶點[21]。HSP90α作為抗腫瘤藥物作用的新靶點，其抑制劑可特異性結合HSP90α， 從而阻斷HSP90α介導的腫瘤細胞的增殖與轉移的信號傳導通路，達到抑制腫瘤的目的[20,23]。基于HSP90α與HCC臨床病理學的密切關系，關于其在HCC發生、發展、預后及治療中的作用需要進一步深入研究。

本研究中logistic分析顯示，作為HSP70家族中的一員，HSPA9與TNM分期及BCLC分期呈負相關。然而已有研究[24]顯示，HSPA9過表達可促進細胞增殖，延長細胞生命周期，并在腫瘤細胞中表達上調。另外，過表達HSPA9可顯著降低凋亡蛋白介導的HepG2腫瘤細胞凋亡[25]。在臨床相關性分析中，HSPA9蛋白表達升高與HCC腫瘤分期升高及血管侵犯有關，具有HCC轉移瘤表型的細胞系中同樣發現有HSPA9 mRNA的高表達。而且，HSPA9高表達與HCC腫瘤轉移及早期復發有關[26]。羅旭等[27]研究發現，HSPA9對HCC侵襲轉移起促進作用。以上研究結果與本研究中結果不一致性。筆者通過檢索HSPA9的基因功能，發現HSPA9可控制細胞增生。鑒于本研究基于GEO數據庫分析，統計過程中未考慮其他臨床病理學特征，可能是導致研究結果與大部分已有的報道不一致的原因，有關HSPA9與HCC患者腫瘤分期的相關性尚需進一步研究證實。

綜上，本研究采用GEO數據庫資料進行數據分析，結論存在一定局限性，部分研究結果與已發表的文獻存在不一致性。另外，HCC為多基因疾病，其發生發展影響因素眾多，本文僅分析了腫瘤組織中HSP表達與腫瘤臨床分期的相關性。因此，關于HSP家族成員在HCC發生發展中的作用仍值得進一步深入研究。

[1] WU SH, CHENG J, ZHENG YJ. Relationship between heat shock protein family and hepatocellular carcinoma[J]. World Chin J Dig, 2005, 13(14): 1725-1730. (in Chinese) 吳順華, 成軍, 鄭玉建. 熱休克蛋白家族與肝癌的關系[J]. 世界華人消化雜志, 2005, 13(14): 1725-1730.

[2] GAO JL, YANG ZG, CHEN XR, et al. Analysis of association between HSP70 expression in tumor tissues and clinicopathological characteristics of HBV-related hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Hepatol, 2015, 31(5): 733-736. (in Chinese) 高加林, 楊宗國, 陳曉蓉, 等. 熱休克蛋白70的表達與HBV相關肝細胞癌臨床病理學特征的相關性分析[J]. 臨床肝膽病雜志, 2015, 31(5): 733-736.

[3] YANG Z, ZHUANG L, SZATMARY P, et al. Upregulation of heat shock proteins (HSPA12A, HSP90B1, HSPA4, HSPA5 and HSPA6) in tumour tissues is associated with poor outcomes from HBV-related early-stage hepatocellular carcinoma [J]. Int J Med Sci, 2015, 12(3): 256-263.

[4] YANG Z, YE P, XU Q, et al. Elevation of serum GGT and LDH levels, together with higher BCLC staging are associated with poor overall survival from hepatocellular carcinoma: a retrospective analysis [J]. Discov Med, 2015, 19(107): 409-418.

[5] ROESSLER S, JIA HL, BUDHU A, et al. A unique metastasis gene signature enables prediction of tumor relapse in early-stage hepatocellular carcinoma patients [J]. Cancer Res, 2010, 70(24): 10202-10212.

[6] International Union Against Cancer (UICC). TNM classification of malignant tumours[S]. 6th ed. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, 2002.

[7] LLOVET JM, BRU C, BRUIX J. Prognosis of hepatocellular carcinoma: the BCLC staging classification [J]. Semin Liver Dis, 1999, 9: 329-338.

[8] YAO DF, DONG ZZ, YAO M. Specific molecular markers in hepatocellular carcinoma [J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2007, 6(3): 241-247.

[9] LIM SO, PARK SG, YOO JH, et al. Expression of heat shock proteins (HSP27, HSP60, HSP70, HSP90, GRP78, GRP94) in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinomas and dysplastic nodules [J]. World J Gastroenterol, 2005, 11(14): 2072-2079.

[10] CUI N, XU YP, CAO ZH, et al. Effects of heat stress on the level of heat shock protein 70 on the surface of hepatocellular carcinoma Hep G2 cells: implications for the treatment of tumors [J]. Tumor Biol, 2013, 34(2): 743-748.

[11] LUO SM, GAO J. Research advances in heat shock protein 70 and hepatocellular carcinoma[J]. Chongqing Med, 2008, 37(2): 188-190. (in Chinese) 羅善明, 高建. 熱休克蛋白70與肝細胞肝癌的研究進展[J]. 重慶醫學, 2008, 37(2): 188-190.

[12] JIANG YG, WANG YM, LI QF. Expression significance of heat shock protein 27, 70, 90αin hepatocellular carcinoma[J]. World Chin J Dig, 2001, 9(7): 755-758. (in Chinese) 蔣業貴, 王宇明, 李奇芬. 肝細胞癌熱休克蛋白27, 70, 90α的表達意義[J]. 世界華人消化雜志, 2001, 9(7): 755-758.

[13] LI RK. Expressions of HSP90α, HSP70, HSP60 incolon cancer tissue and the relationship between the expressions of HSP90α, HSP70, HSP60 and the extent of tissue differentiation[J]. J Clin Exp Med, 2015, 14(9): 721-723. (in Chinese) 李如凱. 結腸癌組織中的HSP90α、HSP70、HSP60表達及其與組織分化程度的關系[J]. 臨床和實驗醫學雜志, 2015, 14(9): 721-723.

[14] HU PZ, YANG SJ, MA FC, et al. Expression of heat shock protein 70 mRNA in human primary hepatocarcinoma[J]. Chin J Diagn Pathol, 2001, 8(4): 220-221. (in Chinese) 胡沛臻, 楊守京, 馬福成, 等. 人原發性肝細胞癌中熱休克蛋白70mRNA的表達[J]. 診斷病理學雜志, 2001, 8(4): 220-221.

[15] YIN YM, QIN QL, ZHAGN W, et al. Overexpression of heat shock protein 70 and spontaneous cancer cell apoptosis in hepatocellular carcinoma[J]. Chin J Hepatol, 2001, 9(2): 84-85. (in Chinese) 尹燕明, 秦慶亮, 張偉, 等. 肝細胞癌熱休克蛋白70過表達與自發性癌細胞凋亡[J]. 中華肝臟病雜志, 2001, 9(2): 84-85.

[16] WANG X, SONG X, ZHUO W, et al. The regulatory mechanism of HSP90alpha secretion and its function in tumor malignancy [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(50): 21288-21293.

[17] LI H, LI WH, ZHANG ZX, et al. Expression of heat shock protein 90α in HBV-related hepatocellular carcinoma[J]. Acad J Guangzhou Med Col, 2014, 42(6): 21-24. (in Chinese) 李慧, 李衛華, 張志翔, 等. 熱休克蛋白90α在HBV相關性肝細胞癌中表達的意義[J]. 廣州醫科大學學報, 2014, 42(6): 21-24.

[18] SU XQ, YAO DF. Relationship between abnormal expression of heat shock protein 90 and malignant transformation of hepatocytes[J]. Chin J Hepatol, 2006, 14(4): 314-317. (in Chinese) 蘇小琴, 姚登福. 熱休克蛋白90家族異常表達與肝細胞癌變關系的研究進展[J]. 中華肝臟病雜志, 2006, 14(4): 314-317.

[19] JOLLY C, MORIMOTO RI. Role of the heat shock response and molecular chaperones in oncogenesis and cell death [J]. J Natl Cancer Inst, 2000, 92(19): 1564-1572.

[20] KONG QQ, ZOU ZQ. Research advances in the association between heat shock protein 90α and primary liver cancer[J]. J Binzhou Med Univ, 2016, 39(4): 289-290. (in Chinese) 孔巧巧, 鄒志強. 熱休克蛋白90α與原發性肝癌關系的研究進展[J]. 濱州醫學院學報, 2016, 39(4): 289-290.

[21] CHEN Y, DING J. Heat shock protein 90:novel target for cancer therapy[J]. Chin J Cancer, 2004, 23(8): 968-974. (in Chinese) 陳奕, 丁健. 熱休克蛋白90-癌癥治療的新靶點[J]. 癌癥, 2004, 23(8): 968-974.

[22] SUN SP, WU SL, GENG ZM, et al. Expression of heat shock protein 90α in hepatocellular carcinoma and its significance[J]. Chin J Bases Clin Gen Surg, 2003, 10(3): 243-245. (in Chinese) 孫水平, 吳勝利, 耿智敏, 等. 肝細胞肝癌中Hsp90α的表達及意義[J]. 中國普外基礎與臨床雜志, 2003, 10(3): 243-245.

[23] LUO HM, SUN W, YIN JY, et al. Progress in the study of heat shock protein 90 inhibitors[J]. Acta Pharm Sin, 2010, 45(7): 813-820. (in Chinese) 羅浩銘, 孫薇, 尹建元, 等. 熱休克蛋白90抑制劑的研究進展[J]. 藥學學報, 2010, 45(7): 813-820.

[24] WADHWA R, TAKANO S, KAUR K, et al. Upregulation of mortalin/mthsp70/Grp75 contributes to human carcinogenesis [J]. Int J Cancer, 2006, 118(120): 2973-2980.

[25] PENG C, YANG P, CUI Y, et al. HSPA9 overexpression inhibits apoptin-induced apoptosis in the HepG2 cell line [J]. Oncol Rep, 2013, 29(6): 2431-2437.

[26] YI X, LUK JM, LEE NP, et al. Association of mortalin (HSPA9) with liver cancer metastasis and prediction for early tumor recurrence [J]. Mol Cell Proteomics, 2008, 7(2): 315-325.

[27] LUO X. Heat shock proteins with transmembrane protein CD151 Mortalin and mechanism of interaction in hepatocellular carcinoma[D]. Kunming: Kunming Med Univ, 2015. (in Chinese) 羅旭. 熱休克蛋白Mortalin與四跨膜蛋白CD151在肝癌中的相互作用及機制研究[D]. 昆明: 昆明醫科大學, 2015.

引證本文：XU QN, LU YF, TANG BZ, et al. Correlation between mRNA expression of heat shock protein in tumor tissue and tumor stage in patients with HBV-related hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(5): 869-874. (in Chinese) 徐慶年， 陸云飛， 湯伯宗， 等. HBV相關肝細胞癌腫瘤組織中熱休克蛋白mRNA表達水平與腫瘤分期的相關性分析[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(5): 869-874.

(本文編輯：劉曉紅)

Correlation between mRNA expression of heat shock protein in tumor tissue and tumor stage in patients with HBV-related hepatocellular carcinoma

XUQingnian,LUYunfei,TANGBozong,etal.

(ShanghaiPublicHealthClinicalCenter,Shanghai201508,China)

Objective To investigate the correlation between mRNA expression of heat shock protein (HSP) and tumor stage in patients with HBV-related hepatocellular carcinoma (HCC). Methods The GSE14520 data set was downloaded from gene expression omnibus in the website of the National Center of Biotechnology Information. A total of 25 HSP genes were obtained from the GSE14520 data, and after the comparison with the clinical data downloaded from the database, 220 HCC patients with mRNA expression of HSP and corresponding clinical data were enrolled. The mRNA expression of HSP in tumor tissues was measured, the TNM stage and Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) stage were determined for each patient, and a correlation analysis was performed. The Kruskal-Wallis H non-parametric test was used for comparison between multiple groups, and univariate and multivariate logistic regression analyses were used to investigate the correlation between HSP and HCC tumor stage. Results With the increase in TNM stage, the expression of HSPA12A, HSPA5, HSP90AA1, and HSPA13 gradually increased (allP<0.05), while the expression of HSP90AA1 gradually increased with the increase in BCLC stage (P<0.05). HSPA4L (OR=1.019,P=0.005), HSPA12A (OR=1.077,P=0.026), and HSP90AA1 (OR=1.001,P=0.002) were risk factors for TNM stage. HSPA9 was negatively correlated with TNM stage (OR=0.995,P=0.011). HSPH1 (OR=1.005,P=0.041), HSPA1B (OR=1.002,P=0.048), and HSPA5 (OR=1.000,P=0.001) were risk factors for BCLC stage, and HSPA9 was negatively correlated with BCLC stage (OR=0.995,P=0.005). Conclusion There is a certain correlation between HSPs and tumor stage in HCC patients. Key words：heat-shock proteins； carcinoma, hepatocellular； neoplasm staging; regression analysis

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.05.015

2016-11-07；

2016-12-23。

上海市衛生和計劃生育委員會中醫藥科研專項課題(2016LP028)；2015年上海市青年醫師培養資助計劃

徐慶年(1968-)，男，副主任醫師，主要研究中西醫結合防治急慢性肝膽疾病。

楊宗國，電子信箱: dr_yangzg@aliyun.com。

R735.7

A

1001-5256(2017)05-0869-06