丙泊酚對新生大鼠腦皮層星形膠質細胞凋亡的影響

劉順翠，陳振毅，黃小庭，廖瑞哲

(廈門大學附屬第一醫院麻醉手術科，福建 廈門 361000)

丙泊酚對新生大鼠腦皮層星形膠質細胞凋亡的影響

劉順翠，陳振毅，黃小庭，廖瑞哲

(廈門大學附屬第一醫院麻醉手術科，福建 廈門 361000)

目的 研究丙泊酚對新生大鼠腦皮層星形膠質細胞凋亡的影響及其機制。方法 原代分離和培養AST細胞，用GFAP免疫細胞化學鑒定。不同濃度丙泊酚(0、10、30、90 μmol·L-1)作用AST細胞8 h。MMT法檢測細胞生存率；Annexin V/PI 雙染檢測細胞凋亡；Western blot 法測定線粒體cyt-C漏出；分光光度計法檢測caspase-3和caspase-9活性。結果 分離培養出原代AST，不同濃度丙泊酚(0、10、30、90 μmol·L-1)濃度依賴性地降低AST細胞生存率,誘導細胞線粒體cyt-C漏出，上調促凋亡蛋白 caspase-3 和caspase-9,誘發AST凋亡。結論 丙泊酚在體外能誘發新生大鼠腦皮層星形膠質細胞凋亡，其機制可能與丙泊酚誘導線粒體cyt-C釋放，激活線粒體凋亡通路有關。

丙泊酚；新生大鼠；大腦；星型膠質細胞；細胞凋亡；細胞色素C

隨著靜脈麻醉技術的完善和相關基礎研究的進展，靜脈麻醉藥丙泊酚(propofol)由于具有快速起效、蘇醒迅速、持續輸注后無蓄積等優點，在嬰幼兒麻醉和鎮靜中廣泛應用[1]。丙泊酚通過與GABAA受體及鈣離子通道結合，延長抑制性突觸后電位，干擾突觸間的信號傳遞，而產生鎮靜和麻醉作用[2]。研究表明，丙泊酚在臨床麻醉濃度內可導致發育期大腦神經毒性[3]，相關機制不明。現有研究報道主要集中在丙泊酚對神經元細胞的直接作用[4-5]，對神經系統其他細胞的影響研究較少。本研究擬通過觀察丙泊酚對星形膠質細胞(astrocytes ,AST)的影響，進而分析其對神經系統的毒性作用機制。通過觀察不同劑量的丙泊酚對新生大鼠腦皮層AST凋亡的影響，分析大鼠腦皮層AST線粒體細胞色素C(cytochrome C,cyt-C)漏出量，促凋亡蛋白caspase-3和caspase-9活性，探討丙泊酚誘發AST凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 新生1～3 d SD大鼠[上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物合格證號:SCXK(滬)2007-0005]，丙泊酚注射液(10 g·L-1，阿斯利康), DMEM高糖培養液、胎牛血清和0.25%胰酶(HyClone)，免疫組化試劑盒(福州邁新)，一抗GFAP(N-18)-R、cyt-C(Santa Cruz)，Annexin V/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒、caspase-3和caspase-9檢測試劑盒(Thermo)。

1.2 AST的原代培養和免疫組化鑒定

1.2.1 AST原代培養和純化 參照文獻報道[6]，將新生1～3 d的SD大鼠乳鼠，-20℃冰箱冷凍麻醉，取兩側大腦皮層組織，預冷的PBS液中漂洗4～5次，用眼科剪剪成糜狀，0.25%胰蛋白酶消化10～15 min，期間用吹管輕輕吹打，使其成為細胞懸液， 10%胎牛血清的高糖DMEM培養基終止消化，離心(800 r·min-1)5 min棄上清，重新加入含有血清的培養基吹打后，靜置10 min，離心(800 r·min-1)5 min棄上清，加入含血清的培養基吹打制成初細胞懸液，用100目、200目篩網過濾，接種到培養皿，于37℃、5% CO2培養箱中培養30～60 min，翻轉培養皿，吸出初細胞懸液，離心(800 r·min-1)5 min棄上清，加入含血清的培養基吹打制成次細胞懸液，將過濾液以培養基稀釋后接種于培養瓶中，接種密度約為1×104個/cm2，以后每隔2～3 d換液1次，連續培養9～14 d，換液時稍加震蕩，并用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，待細胞長滿瓶底，將培養瓶置于37℃恒溫搖床上，以260 r·min-1的速度振搖6 h，去除混雜的神經元細胞和小膠質細胞的上清液，后傳代，重復差速貼壁培養純化細胞，取傳代培養第3次細胞進行實驗。

1.2.2 GFAP免疫細胞化學ABC法鑒定AST 制備細胞爬片，4%多聚甲醛固定， 0.5% Triton X-100破膜，3% H2O2孵育去除內源性過氧化物酶，1 ∶10正常山羊血清封閉，滴加GFAP一抗(1 ∶100)，陰性對照片滴加PBS代替一抗， 4℃孵育過夜，滴加羊抗兔IgG二抗(1 ∶100)孵育，滴加SABC液(1 ∶100)，孵育，DAB顯色，蘇木精復染，自來水沖洗，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照[7]。

1.3 實驗設計及分組 將培養的AST細胞分為對照組和實驗組。用10%脂肪乳溶解丙泊酚，實驗組用不同濃度的丙泊酚處理(10、30、90 μmol·L-1)，對照組用相同體積10%脂肪乳處理。

1.4 MTT法檢測AST細胞增殖 細胞接種于96孔板，待其貼壁后，用不同濃度丙泊酚(10、30、90 μmol·L-1)處理 8 h，檢測細胞增殖情況。方法如下：每孔加MTT 50 μL(終濃度5 g·L-1)，37℃孵育4 h；小心棄去MTT，每孔加DMSO 150 μL，震蕩，充分溶解；用酶標儀在570 nm波長處讀取各樣本OD值。根據公式：細胞存活率/% =(實驗組OD值/對照組OD值)×100%，計算細胞存活率。每組實驗重復3次。

1.5 Annexin V/PI雙染檢測AST細胞凋亡 細胞接種于6孔板，待其貼壁后，用不同濃度丙泊酚(10、30、90 μmol·L-1)處理8 h后收集細胞，用不含EDTA的胰酶消化收集細胞(胰酶消化時間不易過長，否則容易引起假陽性)，PBS洗滌細胞2次，加500 μL的Binding buffer懸浮細胞,加5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI混勻,室溫避光反應5～15 min,1 h內用流式細胞儀檢測，實驗結果用流式分析軟件FlowJo 7.6分析。每組實驗重復3次。

1.6 Western blot檢測AST線粒體cyt-C漏出情況 細胞接種于培養皿，待其貼壁后，用不同濃度丙泊酚(10、30、90 μmol·L-1)處理8 h后收集細胞，按試劑盒方法分別提取AST細胞線粒體蛋白和線粒體外蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度。等量線粒體內外蛋白樣品分別行電泳，轉膜，抗cyto-C抗體室溫孵育，TBST溶液洗滌后，HRP標記的二抗室溫孵育，化學發光，顯影定影，掃描后用圖像處理軟件Phoretix 1D分析目標條帶的灰度值。每組實驗重復3次。

1.7 分光光度法檢測AST caspase-3和caspase-9活性 細胞接種于培養皿，待其貼壁后，用不同濃度丙泊酚(10、30、90 μmol·L-1)處理8 h后收集細胞，預冷PBS洗滌3次, 4℃ Lysis buffer(每50 μL加入0.5 μL DTT)，冰上裂解30 min,離心取上清, 用BCA蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度。等量對照組和處理組細胞裂解液與caspase-3或caspase-9底物37℃孵育4 h。催化產生的黃色產物用于定量caspase活性。用全自動酶標儀于405 nm波長測定各孔的吸光度(A405)值。Caspase相對活性/%=(處理組A405值/對照組A405值)×100%[8]。每組實驗重復3次。

2 結果

2.1 AST細胞鑒定 骨架蛋白GFAP為成熟AST的特異性標記物。GFAP免疫組織化學結果顯示，陽性產物呈棕黃色，主要分布于胞質中，胞核未著色。隨機選擇6個視野，分別計數200個細胞，陽性細胞數95%以上，證實獲得的為AST，且純度較高，可用于后續實驗(Fig 1)。

Fig 1 GFAP stained astrocytes identified by immunohistochemistry A:×100; B:×200

2.2 丙泊酚處理降低AST細胞生存率 運用MTT法測定細胞生存率。如Fig 2所示，10、30、90 μmol·L-1丙泊酚處理組細胞生存率呈劑量依賴性地降低，與對照組比較，30、90 μmol·L-1丙泊酚處理組細胞生存率明顯下降(P<0.01)。

##P<0.01vscontrol

2.3 丙泊酚誘導AST細胞凋亡 Annexin V/PI雙染檢測AST細胞凋亡。如Fig 3所示，對照組細胞凋亡率僅為(3.90±0.61)%;10、30、90 μmol·L-1丙泊酚處理組細胞凋亡率逐漸升高，分別為(5.11±0.87)%、(6.53±1.18)%(P<0.05)、(9.74±1.51)%(P<0.01)。

2.4 丙泊酚誘導AST線粒體cyt-C釋放 蛋白免疫印跡結果如Fig 4所示，同對照組比較10、30、90 μmol·L-1丙泊酚處理組細胞線粒體cyt-C外漏逐漸增加。30、90 μmol·L-1丙泊酚處理組cyt-C外漏明顯增加(P<0.05)。

#P<0.05，##P<0.01vscontrol

2.5 丙泊酚誘導促凋亡蛋白caspase-3和caspase-9活性增加 分光光度法檢測AST caspase-3和caspase- 9活性，結果如Fig 5所示，同對照組比較，10、30、90 μmol·L-1丙泊酚處理組細胞，促凋亡蛋白caspase-3和caspase-9活性逐漸增加。30、90 μmol·L-1丙泊酚處理組caspase-3和caspase-9活性明顯增加(P<0.05)。

3 討論

丙泊酚在嬰幼兒麻醉和鎮靜中廣泛應用，然而大腦在發育期對全麻藥誘發神經系統損傷的敏感性明顯增加[5]，但其相關作用機制不明。丙泊酚通過與GABAA受體及鈣離子通道結合，延長抑制性突觸后電位，干擾突觸間的信號傳遞，而產生鎮靜和麻醉作用，但研究認為GABAA受體激活與丙泊酚誘發的發育期大腦神經毒性無關[2]。臨床研究表明，嬰幼兒多次經歷全麻可導致學習能力缺陷的風險增加[9]；動物實驗表明，丙泊酚在臨床相關濃度內可損害其空間學習記憶能力[10]，可能與丙泊酚誘發發育期大腦廣泛神經元凋亡等神經毒性有關[11]，但是其具體機制是什么？對神經系統還有怎樣的影響? 目前的研究多集中在丙泊酚對神經元的直接作用方面，對中樞神經系統(CNS)中其他細胞的影響研究不多。

Fig 4 Effects of propofol on cytochrome C

#P<0.05，##P<0.01vscontrol

Fig 5 Effects of propofol on activity of caspase-3

#P<0.05，##P<0.01vscontrol

在CNS中，膠質細胞的數量遠遠超過神經元，占細胞總數的90%以上。近年來研究發現，膠質細胞在CNS中不僅僅起支持、營養、修復和吞噬等作用，膠質細胞，尤其是星形膠質細胞(AST)和小膠質細胞，并非完全的輔助細胞，它們參與了神經元在腦內活動，在引導突觸發生、促進突觸生長、誘導突觸凋亡、調節突觸傳遞和維持突觸的正常功能等方面具有重要作用[12-13]。特別是發育期大腦膠質細胞對于神經系統的發育起關鍵作用，但是在靜脈麻醉藥丙泊酚誘發的發育期大腦損傷中，丙泊酚對AST會產生什么樣的影響，現有研究還不明確。

本研究選用出生1～3 d的新生SD大鼠，此時SD大鼠大腦皮層處于發育期，AST比例較大。實驗過程中，通過將培養瓶置于37℃恒溫搖床上，以260 r·min-1的速度振搖6 h，去除混雜的神經元細胞和小膠質細胞，后用反復差數貼壁培養的方法純化去除混雜的成纖維細胞及其他細胞，以得到純度較高的發育期AST后，用不同濃度丙泊酚(10、30、90 μmol·L-1)處理細胞8 h，發現丙泊酚在臨床維持全麻狀態的藥物濃度(30 μmol·L-1)可明顯抑制AST細胞增殖、誘導細胞凋亡。

腦正常發育過程中，神經膠質細胞發生生理性凋亡以適應腦功能和結構的變化。相關資料顯示，內源性細胞凋亡機制有：① 線粒體途徑誘導細胞凋亡：細胞在死亡誘導因子(如氧化應激和鈣超載)作用下，線粒體細胞色素 C 漏出進入細胞質， Apaf-1 與之結合活化，依次激活caspase-9與caspase-3，募集下游眾多的caspase，導致內源性細胞凋亡[14]；② 內質網應激誘導細胞凋亡：DNR損傷的心肌細胞內質網功能內穩態失衡,形成內質網應激，活化caspase-12和caspase-3，募集下游眾多的caspase，導致內源性細胞凋亡[15]。 但本研究發現，丙泊酚在臨床維持全麻狀態的藥物濃度(30 μmol·L-1)明顯增加AST線粒體cyt-C外漏， 增加caspase-9與caspase-3活性，提示丙泊酚可能通過誘導線粒體cyt-C外漏，誘發線粒體途徑的AST凋亡，而影響了腦正常發育過程。

總之,本研究結果表明體外臨床麻醉劑量的丙泊酚可誘導AST凋亡增加，機制可能與丙泊酚誘發發育期大腦神經星形膠質細胞線粒體損傷，導致線粒體cyt-C外漏增加有關。

(致謝:感謝廈門大學實驗動物中心和廈門大學附屬第一醫院中心實驗室提供的實驗條件和技術支持!)

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Effect of propofol on apoptosis of cortical astrocytes isolated from neonatal rats

LIU Shun-cui, CHEN Zhen-yi, HUANG Xiao-ting, LIAO Rui-zhe
(DeptofAnesthesiologyandSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofXiamenUniversity，XiamenFujian361000,China)

Aim To study the effects of propofol on apoptosis of cortical astrocytes isolated from neonatal rats.Methods Pure astrocytes (AST) were obtained from the cultured cerebral cortical cells and identified by the GFAP stain technology in neonatal rats. AST cells were treated with different concentrations of propofol(0,10, 30, 90 μmol·L-1) for 8 hours. Cell viability was measured by MTT method, and the apoptosis was detected by Annexin V/PI double staining. Cytochrome C (cyt-C) leakage was detected by Western blot. Caspase-3 and caspase-9 activities were measured by spectrophotometry.Results AST cells were administered with different concentrations of propofol(0,10,30, 90 μmol·L-1) for 8 hours. It decreased the survival rate in a concentration-dependent manner, induced the leakage of cyt-C in mitochondria, up-regulated the expression of pro-apoptotic protein caspase-3 and caspase-9, and induced AST apoptosis.Conclusion Propofol induces the apoptosis of astrocytes in neonatal rat cortexinvitro, which may be related to the activation of mitochondria apoptosis pathway induced by mitochondrial cyt-C release.

propofol; neonatal rats； brain; astrocytes; apoptosis; cytochrome C

2017-02-15,

2017-03-13

福建省教育廳中青年教師教育科研資助項目(No JA15861)；福建自然科學基金資助項目(No 2017J01358)

劉順翠(1976-),女,副主任醫師,研究方向:麻醉藥理學,E-mail: 514096301@qq.com; 廖瑞哲(1977-),女,副主任醫師,研究方向:麻醉藥理學,通訊作者,E-mail: 531271662@qq.com

時間：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.040.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.020

A

1001-1978(2017)05-0691-05

R-322；R322.81；R329.25；R971.2