LC-MS/MS法測定人血漿中吡非尼酮及其代謝產物的濃度

李長印，宋慧婷，宗 陽，張 軍，居文政

(南京中醫藥大學附屬醫院臨床藥理實驗室，江蘇 南京 210029)

LC-MS/MS法測定人血漿中吡非尼酮及其代謝產物的濃度

李長印，宋慧婷，宗 陽，張 軍，居文政

(南京中醫藥大學附屬醫院臨床藥理實驗室，江蘇 南京 210029)

目的 建立LC-MS/MS法測定人血漿中吡非尼酮(pirfenidone，BT)及其主要代謝產物5-羧基吡非尼酮(5-carboxy-pirfenidone，SBT)的含量。方法 血漿樣品加入氘代同位素內標吡非尼酮-d5(dBT)和5-羧基吡非尼酮-d5(dSBT)，經甲醇沉淀蛋白后進樣。液相分離采用Agilent ZORBAX SB C18(3.0 mm×100 mm，3.5 μm)色譜柱，流動相為水(含0.5%甲酸)/乙腈(50/50)。質譜檢測采用ESI離子源，正離子多反應檢測模式檢測。BT、SBT、dBT和dSBT的檢測目標離子對分別為m/z 185.958/77.1、215.944/77.0、190.965/81.1和220.948/99.1。結果 空白溶劑、空白血漿無干擾，分析物及內標間無相互干擾。血漿中BT和SBT分別在0.020 59～25.14 mg·L-1和0.016 73～20.42 mg·L-1范圍內線性關系良好。批內、批間精密度和準確度均在可接受范圍內。分析物及內標儲備液于4 ℃冰箱中放置156 d，血漿樣本于室溫放置4 h、-70 ℃冰箱中保存并反復凍融3次、-70 ℃冰箱保存10、29、52 d及樣品處理后自動進樣器(8 ℃)中放置24 h的情況下均穩定。BT和SBT的平均提取回收率和歸一化基質因子均在可接受范圍內。結論 本研究所建立的測定BT和SBT血漿藥物濃度的LC-MS/MS分析方法具有良好的特異性、準確度、精密度、靈敏度、穩定性和耐用性，適用于人血漿中吡非尼酮及其代謝物的濃度測定及其藥動學研究。

吡非尼酮；5-羧基吡非尼酮；LC-MS/MS；人血漿藥物濃度；藥代動力學；多反應檢測模式

吡非尼酮(pirfenidone，BT)，化學名5-甲基-1-苯基-2 (1H )-吡啶酮, 是一種新型廣譜抗纖維化藥物。BT是一種有效的細胞因子抑制劑，能夠通過參與調節某些因子，抑制成纖維細胞的生物學活性，導致細胞增殖受抑，基質膠原合成減少[1]。其主要作用機制為清除活性氧，抑制脂質過氧化；抑制轉化生長因子-β(TGF-β)基因的過度表達，減少TGF-β的生成；減少血小板衍化生長因子(PDGF)的生成；抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的生成，減輕炎癥反應等[2-3]。臨床實驗表明，BT可以改善特發性肺纖維化患者的肺功能下降，一定程度地延緩疾病進展[4-5]。BT在人體內經肝內細胞色素P450 酶代謝后，約87.76%的藥物以5-羧基吡非尼酮(5-carboxy-pirfenidone，SBT)的形式從尿液排出[6-7]，該代謝物與吡非尼酮抗纖維化作用的相關性也在一定程度上得到了證明[8]。因此，同時描述BT和其主要代謝產物SBT的體內藥代動力學行為，可以更全面評價該藥的藥代動力學特征。

目前，已有研究報道了人血漿中BT濃度的測定方法和臨床藥動學參數，主要方法有高效液相色譜法(HPLC)[9-10]和液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[11]。HPLC 法繁瑣且靈敏度較低，不利于臨床應用時樣品的批量分析。而LC-MS/MS法更為快速、靈敏度高、專屬性強，更加適合人血漿中藥物濃度的測定[12-13]。但在已報道的LC-MS/MS法中[11]，研究者未建立SBT測定方法，這不利于對該藥在人體內的吸收、分布、消除、代謝規律進行全面評價。基于此，本研究擬建立一種同時測定人體血漿中BT和SBT藥物濃度的LC-MS/MS方法，并進行全面的方法學驗證，以用于后續人體藥代動力學的系統研究。

1 材料

1.1 藥品與試劑 吡非尼酮(BT)對照品(浙江金華康恩貝生物制藥有限公司，批號130603，含量100.2%，結構如Fig 1A所示)；5-羧基吡非尼酮(SBT)對照品(南京華威醫藥科技開發有限公司，含量99.79%，結構如Fig 1B所示)；吡非尼酮-d5(dBT)對照品(BT的同位素內標，加拿大TRC公司，批號17-WG-177-2，化學純度為99.7%，同位素純度為98%，每瓶1 mg)；5-羧基吡非尼酮-d5(dSBT)對照品(SBT的同位素內標，加拿大TRC公司，批號17-WG-177-1，化學純度為99.9%，同位素純度為99%，每瓶1 mg)；甲酸(ROE Scientific Inc.，USA，HPLC級，批號2B3026)；甲醇和乙腈(Merck Company，HPLC級)；超純水由Millipore Milli-Q Advantage A10超純水機制備；其余試劑為分析純。吡非尼酮片(浙江金華康恩貝生物制藥有限公司提供，批號1308002)。人空白血漿源自江蘇省血液中心。

Fig 1 Chemical structures of BT(A) and SBT(B)

1.2 儀器 (Agilent)LC-(AB)API4000 MS/MS液質聯用儀(含Pump Agilent 1260G1312A，Auto Sampler Agilent 1260G1367E，Column Oven Agilent 1260G1316A和Mass spectrometer API4000)，LC-MS/MS系統由Analyst 1.6 Software 控制；CPA225D電子天平(德國賽多利斯公司)；高速低溫離心機(Thermo Sorvall Legend Micro 17R, PT021)；VTX-3000L旋渦混合儀(日本LMS公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件 色譜條件：Agilent ZORBAX SB C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，3.5 μm)，Agilent ZORAX SB-C8預柱(2.1 mm×12.5 mm，5 μm)，流動相為水(0.5%甲酸)/乙腈(50/50)，流速350 μL·min-1，柱溫35 ℃，分析4 min，進樣體積5 μL。

質譜條件：ESI離子源，正離子模式檢測，掃描模式為多反應檢測(MRM)。BT的檢測目標離子對為m/z185.958/77.1，DP為80 V，CE為40 eV，CXP為6 V；SBT的檢測目標離子對為m/z 215.944/77.0，DP為85 V，CE為51 eV，CXP為6V；dBT的檢測目標離子對為m/z 190.965/81.1，DP為76 V，CE為47 eV，CXP為6V；dSBT的檢測目標離子對為m/z 220.948/99.1，DP為71 V，CE為41 eV，CXP為8 V。其他主要質譜參數如下：Dwell Time 150 ms，EP為10 V，碰撞氣(CAD)6 psi，氣簾氣(CUR)35 psi，輔助氣1(GS1)45 psi，輔助氣2(GS2)45 psi，電噴霧電壓(IS)5 500 V，離子源溫度(TEM)550 ℃。

2.2 標準溶液的配制

2.2.1 BT和SBT對照品儲備液的配制 精密稱取BT 對照品12.57 mg和SBT 對照品10.21 mg分別于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解、定容，混勻即得濃度為1.257 g·L-1的BT標準曲線儲備液和濃度為1.021 g·L-1的SBT標準曲線儲備液，于4 ℃冰箱中保存備用。將BT和SBT儲備液等體積混合均勻后，用甲醇將其逐級稀釋得到含BT濃度分別為0.103 0、0.205 9、0.514 9、1.287、3.218、8.045、20.11、50.28、125.7 mg·L-1以及含SBT濃度分別為0.083 64、0.167 3、0.418 2、1.046、2.614、6.534、16.34、40.84、102.1 mg·L-1的系列標準曲線工作液。

精密稱取BT 對照品12.67 mg和SBT 對照品10.39 mg分別于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解、定容，混勻即得濃度為1.267 g·L-1的BT質控儲備液和濃度為1.039 g·L-1的SBT質控儲備液，于4 ℃冰箱中保存備用。以甲醇為溶劑，對BT和SBT質控儲備液分別進行系列稀釋，而后進行等體積混勻，得到BT濃度分別為0.519 0、12.97、202.7 mg·L-1和SBT濃度分別為0.425 6、10.64、166.2 mg·L-1的質控工作液。

2.2.2 內標儲備液的配制 分別取規格為每瓶1 mg的dBT和dSBT各1瓶，分別精密加入1 mL甲醇，渦旋混勻，即得濃度為1 g·L-1的dBT和dSBT儲備液。將dBT和dSBT儲備液分別用甲醇稀釋100倍后，等體積混合均勻，即得濃度為5 mg·L-1的內標工作液。

2.3 血漿樣品處理

2.3.1 受試者含藥血漿樣品處理 自-70 ℃低溫冰箱中取出受試者的含藥血漿樣品，室溫解凍后，渦旋振蕩30 s充分混勻，12 000g×10 min，4 ℃,超速離心。精密吸取離心后血漿中層100 μL于1.5 mL EP管中，分別依次加入濃度為5 mg·L-1的內標工作液20 μL，甲醇880 μL，渦旋3 min進行蛋白沉淀，12 000g×10 min，4 ℃離心，吸取上清液300 μL，加入700 μL流動相(即含0.25%甲酸的50%乙腈水溶液)，渦旋混勻后進行LC-MS/MS 分析。空白血漿除未加內標外，其余樣品處理方法相同。

2.3.2 血漿標準曲線樣品的配制與處理 自-70 ℃低溫冰箱中取出空白血漿樣品，室溫解凍后，渦旋振蕩30 s充分混勻，12 000g×10 min，4 ℃，超速離心。精密吸取離心后血漿中層100 μL于1.5 mL EP管中，分別依次加入不同濃度的系列標曲工作液20 μL，得到含BT濃度分別為0.020 59、0.041 19、0.103、0.257 4、0.643 6、1.609、4.022、10.06、25.14 mg·L-1，含SBT濃度分別為0.016 73、0.033 46、0.083 64、0.209 1、0.522 8、1.307、3.267、8.168、20.42 mg·L-1的系列血漿標準曲線工作液，后續處理過程同“2.3.1”項下要求。同法制備并分析雙空白樣品和零點樣品，其中雙空白樣品僅加入100 μL空白血漿和900 μL甲醇，而零點樣品加入100 μL血漿、20 μL內標工作液和880 μL甲醇。

A：Blank human plasma;B：BT and SBT spiked plasma sample(0.020 59 and 0.016 73 mg·L-1) for LLOQ; C：Methanol solution of standard mixture for BT(1.297 mg·L-1)，SBT(1.064 mg·L-1) and IS; D：BT and SBT spiked plasma sample (1.297 and 1.064 mg·L-1) for quality control; E：Plasma sample obtained from a volunteer 3 h after oral administration of pirfenidone tablets containing 200 mg of BT

2.3.3 血漿質控樣品的配制與處理 取不同濃度的系列質控工作液各20 μL于1.5 mL EP管中，向其中分別加入100 μL空白血漿，渦旋混勻，即得含BT濃度分別為0.051 90、1.297和20.27 mg·L-1，SBT濃度分別為0.042 56、1.064和16.62 mg·L-1的血漿質控樣品，后續處理過程同“2.3.1”項下要求。

2.4 分析方法的驗證

2.4.1 方法的特異性 在選定的LC-MS/MS條件下，方法的特異性色譜圖見Fig 2。SBT和dSBT色譜峰的保留時間為1.9 min左右，BT和dBT色譜峰的保留時間為3.0 min左右。空白血漿及空白溶劑均無雜質峰干擾分析物和內標的準確測定；內標及分析物間不存在影響測定準確度的相互干擾。所以本方法可以用于BT和SBT血漿藥物濃度的準確測定。

2.4.3 精密度和準確度考察 按 “2.3.2”項配制處理標準曲線最低點濃度血漿樣本(LLOQ)，同時按“2.3.3”項配制處理低、中、高3種濃度的血漿質控樣本，每個濃度每批平行制備5個樣本，連續制備并測定3批，每批隨行一條標準曲線。記錄色譜圖、分析物峰面積As和內標峰面積Ai。計算As和Ai的比值f(f=As/Ai)，將f值代入隨行標準曲線求得實測濃度及其Ac%。批內和批間精密度分別用批內(n=5)和3批間(n=15)的濃度實測值的RSD值表示。考察結果如Tab 1、2所示，結果表明該方法的批內和批間精密度和準確度良好。

2.4.4 穩定性考察

2.4.4.1 分析物和內標儲備液穩定性 精密吸取“2.2”項下新鮮配制的BT、SBT、dBT和dSBT儲備液(Ⅰ)和已于4 ℃冰箱中放置156 d的儲備液(Ⅱ)適量，分別用甲醇將其稀釋至適當濃度后進樣分析，每種儲備液平行3份。以儲備液(Ⅰ)稀釋液的平均測定值標定儲備液(Ⅱ)稀釋液的濃度，并求其Ac%和RSD%(n=3)。測定結果顯示，與儲備液(Ⅰ)相比，儲備液(Ⅱ)中SBT、BT、dSBT和dBT的Ac%分別為101.2、100.2、100.7和101.0，RSD%分別為0.71、0.38、0.88和1.76。結果表明，分析物和內標于4 ℃冰箱中放置156 d后仍穩定。

2.4.4.2 血漿樣本穩定性 按“2.3.3”項配制QA低、中、高3種濃度的血漿質控樣本，平行3份。分別考察血漿樣本室溫放置4 h、-70 ℃冰箱中保存并反復凍融3次、-70 ℃冰箱保存10、29、52 d及樣品處理后自動進樣器(8 ℃)中放置24 h的穩定性。考察結果見Tab 3、4，結果表明在上述各種條件下樣品的穩定性良好。

Tab 1 Intra- and inter-batch precision and accuracy for determination of BT in human plasma

Tab 2 Intra- and inter-batch precision and accuracy for determination of SBT in human plasma

Tab 3 Results of stability of BT in human plasma

Tab 4 Results of stability of SBT in human plasma

2.4.5 提取回收率考察 按“2.3.3”項配制處理并測定低、中、高3種濃度的血漿質控樣本，每個濃度平行3個樣本。記錄色譜圖、分析物峰面積(As)B和內標峰面積(Ai)B，計算其峰面積比值fB[fB=(As)B/(Ai)B]。按“2.3.1”項處理獲得空白血漿洗脫液若干用于配制未經提取含藥血漿樣品。分別精密吸取低、中、高質控工作液各20 μL于1.5 mL EP管中，向其中分別依次加入內標工作液20 μL、空白血漿洗脫液960 μL，渦旋混勻，吸取上清液300 μL，加入流動相700 μL，渦旋混勻后進行LC-MS/MS 分析。每個濃度平行3個樣本。記錄色譜圖、分析物峰面積(As)A和內標峰面積(Ai)A，計算其峰面積比值fA[fA=(As)A/(Ai)A]，并求算同一濃度樣品的比值平均值(fA)mean(n=3)。分析物的相對提取回收率REC=fB/(fA)mean。結果顯示：SBT低、中、高3個濃度血漿質控樣本的平均提取回收率分別為94.32%、90.72%和88.73%，RSD分別為3.01%、1.45%和3.25%；BT低、中、高3個濃度血漿質控樣本的平均提取回收率分別為106.4%、105.3%和101.9%，RSD分別為3.07%、1.32%和3.91%。結果表明，該方法BT和SBT的提取回收率精密且可重現。

2.4.6 基質效應 按“2.3.1”項處理6種不同來源的空白血漿，獲得其相應的空白血漿洗脫液。分別精密吸取低、中、高質控工作液各20 μL于1.5 mL EP管中，向其中分別依次加入內標工作液20 μL、甲醇960 μL，渦旋混勻，渦旋混勻，吸取上清液300 μL，加入流動相700 μL，渦旋混勻后進行LC-MS/MS分析。每個濃度平行3個樣本。記錄色譜圖、分析物峰面積(As)C和內標峰面積(Ai)C。計算分析物基質因子fA=As/(As)C，內標基質因子fi=Ai/(Ai)C，進一步計算經內標歸一化的基質因子fAi=(fA)mean/(fi)mean。結果顯示：SBT低、中、高3個濃度血漿質控樣本的平均歸一化基質因子分別為102.5%、95.16%和102.7%，RSD分別為11.23%、3.96%和1.34%；BT低、中、高3個濃度血漿質控樣本的平均歸一化基質因子分別為96.33%、95.30%和101.3%，RSD分別為2.30%、3.65%和1.79%。結果表明，該方法中SBT和BT的基質效應精密且可重現。

2.4.7 分析系統殘留 在進樣標準曲線ULOQ樣品后設置進樣空白甲醇樣品，記錄色譜圖，考察分析物的系統殘留。考察結果顯示，其色譜圖中BT、SBT、dBT和dSBT保留時間附近均無明顯干擾峰存在。這表明，在選定的LC-MS/MS條件下，系統的殘留效應在可接受范圍內，不影響測定準確度。

2.5 應用 36名健康受試者，男女各半，簽署知情同意書，并經南京中醫藥大學附屬醫院倫理委員會審批同意，均分為低、中、高3個劑量組進行藥代動力學實驗。3組分別口服劑量為200、400、600 mg的BT片，采集口服前、口服開始后10、20、30、45 min和1.0、1.5、2、3、4、6、8、12 h由肘靜脈取血4 mL置肝素化采血管中，混勻，離心(3 000 r·min-1，4 ℃，10 min)，分離上層血漿，將血漿分成兩等份，轉移至EP管中，于-70 ℃冰箱中保存待測。測定結果顯示，低、中、高3個劑量組的BT血藥濃度范圍分別為0.025 06～3.887 mg·L-1，0.042 78～5.19 mg·L-1，0.045 26～6.792 mg·L-1；SBT血藥濃度范圍分別為0.031 19～4.854 mg·L-1，0.040 19～14 mg·L-1，0.065 07～9.965 mg·L-1。上述結果表明，所建立的BT和SBT血藥濃度LC-MS/MS分析測定方法適用于BT和SBT人體藥代動力學的系統研究。

3 討論

本研究建立并驗證了同時測定人血漿中BT和SBT的LC-MS/MS方法，與先前報道的測定BT的LC-UV和LC-MS/MS方法相比，均具有一些改進之處。與LC-UV相比，該方法分析時間大幅度縮短，僅在4 min內便實現了對BT、SBT及其內標的完全分離；而與先前LC-MS/MS法相比，本方法同時對人血漿中BT和SBT濃度實現準確測定，從而可更全面地監測BT在機體內的代謝和消除情況。此外該方法采用dBT和dSBT作為定量用內標，使得方法的穩定性和準確度更加良好；同時相比分析物而言，我們采用了不同的離子對監測同位素內標，消除了內標和分析物間的相互干擾，使得方法具有良好的特異性；而儲備液穩定性考察結果則表明分析物和同位素內標均很穩定。

3個不同劑量組的人體藥代動力學研究中血藥濃度測定結果顯示，所有樣品中BT和SBT的血藥濃度均可在方法的線性范圍內得到準確測定，充分證明了該方法在BT人體藥動學和生物等效性等相關研究中的適用性。

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Determination of pirfenidone and its major metabolite in human plasma by LC-MS/MS analysis

LI Chang-yin, SONG Hui-ting, ZONG Yang, ZHANG Jun, JU Wen-zheng
(DeptofClinicalPharmacology,AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029,China)

Aim To establish a LC-MS/MS method for the determination of pirfenidone(BT) and its major metabolite 5-carboxy-pirfenidone(SBT) in human plasma.Methods Human plasma samples containing BT and SBT, as well as their corresponding deuterium-labeled internal standards pirfenidone-d5(dBT) and 5-carboxy-pirfenidone-d5(dSBT), were precipitated using methanol. Chromatographic separation was carried out on an Agilent ZORBAX SB C18(3.0 mm×100 mm, 3.5 μm) column with the mobile phase of water(0.5% formic acid) and acetonitrile(50/50). The detection of analytes was performed on a tandem mass system equipped with an electrospray ionization source in positive ion mode using multiple-reaction monitoring. The MS/MS ion transitions monitored were m/z 185.958→77.1 for BT, m/z 215.944→77.0 for SBT, m/z 190.965→81.1 for dBT and m/z 220.948→99.1 for dSBT.Results There was no remarkable interference in blank solvent, plasma, and there was no mutual interference between analytes or internal standards. The proposed method showed good linearity over the concentration range of 0.020 59～25.14 mg·L-1for BT and 0.016 73～20.42 mg·L-1for SBT. The intra-batch and inter-batch precision and accuracy were proved to be acceptable. Human samples kept stable after 4 h at room temperature, the three freeze-thaw cycles and 10, 29 and 52 days at -70 ℃, and the processed samples remained stable after 24 h in the autosampler. The average extraction recovery and matrix effect were precise, reproducible and acceptable.Conclusion Our current LC-MS/MS method is proved to be sensitive, accurate and convenient, and could be suitable for the clinical pharmacokinetic studies of BT-related preparations.

pirfenidone; 5-carboxy-pirfenidone; LC-MS/MS; human plasma concentration; pharmacokinetics; multi-reaction monitoring mode

2017-02-11,

2017-03-15

國家自然科學基金青年項目(No 81503300)；江蘇省中醫院高峰人才項目(No y2014rc17)；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(2014)

李長印(1983-)，男，博士，助理研究員，研究方向：中藥藥效物質基礎和藥代動力學，E-mail：changyinli2006@126.com； 居文政(1965-)，男，博士，主任中藥師，博士生導師，研究方向：中藥臨床藥代動力學，通訊作者，E-mail：wzhju333@163.com

時間：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.042.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.021

A

1001-1978(2017)05-0696-08

R446.11；R563.13；R916.4；R969.1