丹紅注射液7種藥效物質基礎的人血漿蛋白結合率

張 倩，戴國梁，居文政，郭建明，孫冰婷，宗 陽，何書芬，段金廒

(1.南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029；2. 南京中醫藥大學江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心， 江蘇 南京 210046)

丹紅注射液7種藥效物質基礎的人血漿蛋白結合率

張 倩1,2，戴國梁1，居文政1，郭建明2，孫冰婷1，宗 陽1，何書芬1，段金廒2

(1.南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029；2. 南京中醫藥大學江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心， 江蘇 南京 210046)

目的 建立同時測定丹紅注射液中7種主要藥效物質基礎丹參素、原兒茶醛等體外人血漿蛋白結合率的方法，并將結果與同等濃度條件下每個單體化合物的人血漿蛋白結合率進行比較，以考察兩者是否存在顯著性差異，由此推測多組分之間是否存在血漿蛋白競爭性結合。為丹紅注射液主要藥效物質基礎的體內藥動學，及其在臨床聯合用藥時的體內藥動學相互作用研究提供參考依據。方法 采用平衡透析法測定血漿蛋白結合率，HPLC測定丹紅注射液中7種成分，及每種成分單獨透析平衡時的血藥濃度及游離藥物濃度。結果 在3種濃度的丹紅注射液中，丹參素、原兒茶醛、p-香豆酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B的人血漿蛋白結合率分別為(11.88±0.58)%、(78.35±1.72)%、(63.48±2.17)%、(87.72±0.78)%、(82.77±2.83)%、(71.59 ± 0.81)%和(70.55±1.34)%；而同等濃度條件下，這7種單體化合物的人血漿蛋白結合率分別為(23.34±1.06)%、(79.32±1.41)%、(78.97±0.08)%、(92.37±0.66)%、(84.95±0.38)%、(79.15±5.47)%和(75.49±0.75)%。與單體化合物的血漿蛋白結合率相比，丹參素、p-香豆酸和紫草酸在丹紅注射液樣品中的人血漿蛋白結合率差異有顯著性；在本實驗的藥物濃度范圍內，只有紫草酸的人血漿蛋白結合率與濃度呈線性；原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸和丹酚酸B的人血漿蛋白結合率差異沒有顯著性。結論 該測定方法簡便易行，準確度、穩定性均較好。實驗條件下，原兒茶醛、p-香豆酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B的人血漿蛋白結合率均>60%，且在樣品體系中這7種成分的血漿蛋白結合率均比單獨給藥的血漿蛋白結合率低，組分之間可能存在競爭性結合，但競爭影響可能較弱。考察血漿蛋白競爭性結合對該藥的藥物相互作用影響時，其組分間的相互競爭影響較小。

丹紅注射液；酚酸類化合物；人血漿蛋白結合率；多組分競爭性結合；藥物相互作用；平衡透析法

丹紅注射液(Danhong injection, DHI)由活血藥對丹參、紅花組成，臨床被廣泛應用于治療心肌梗死、心絞痛、腦梗死等心腦血管疾病，療效確切[1-3]。大數據統計顯示，該品種為臨床應用最多的活血化瘀類中藥注射劑之一[4]，已有較深入的藥效物質基礎及其體內過程研究，其中含量較高者為來自丹參中的兒茶酚類化合物丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、p-香豆酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A[5-6]。但目前尚未見報道DHI中這些藥效物質基礎的血漿蛋白結合率。血漿蛋白結合率作為藥代動力學的重要參數，影響藥物的體內暴露量，血漿蛋白結合率較高的藥物臨床更易發生相互作用[7]。目前，已有部分研究報道丹參和紅花中主要物質基礎的血漿蛋白結合率，如丹酚酸B與羥基紅花黃色素A等[8-9]，血漿蛋白結合率均較高。在中藥復雜體系中，這些藥效物質基礎之間可能會競爭結合血漿蛋白，從而改變體內游離藥物濃度，進一步影響藥效發揮。因此，研究這類藥效物質基礎在DHI中的血漿蛋白結合率，將為深入研究DHI藥物體內相互作用提供參考依據。

本課題組在前期研究基礎上，擬運用平衡透析法測定DHI中7種主要藥效物質基礎的人血漿蛋白結合率[10]，并與同等濃度條件下單用這7種化合物的人血漿蛋白結合率進行比較，考察兩組之間人血漿蛋白結合率的差異，以推測多組分之間是否存在血漿蛋白競爭性結合。

1 材料

Agilent 1100高效液相色譜儀(Agilent, USA)；Agilent G1314A可變波長紫外檢測器；Satorius電子天平(Satorius，Germany)；CentriVap離心濃縮系統(Labconco, USA)；Micro-17R型冷凍離心機(Thermo, USA)；透析袋(14000 D，壓平寬度25 mm，Union Carbide, USA)；Direct-Q5超純水機(Millipore, USA)。

丹紅注射液(山東丹紅制藥有限公司，批號15081038)；丹參素、原兒茶醛、p-香豆酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B標準品(南京元寶山色譜有限公司，批號20151128，含量均≥98%)；乙腈、甲醇和甲酸均為色譜純；超純水由純水制備系統Direct-Q5制備；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉均為分析純；病毒滅活冰凍人血漿(由南京中醫藥大學附屬醫院血庫提供，批號：D6641000)。

2 方法

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；柱溫35℃；流速1.0 mL·min-1；檢測波長0～20 min 280 nm，20～40 min 326 nm，45～60 min 280 nm。進樣量10 μL。流動相乙腈(A)-0.5%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～10 min(A：5%～5%)，10～15 min(A：5%～16%)，15～20 min(A：16%～20%)，20～25 min(A：20%～20%)，25～27 min(A：20%～22%)，27～35 min(A：22%～22%)，35～40 min(A：22%～90%)，40～45 min(A：90%～5%)； 45～60 min(A：5%～5%)。

2.2 溶液配制 空白透析液：按文獻方法[8]配制0.01 mol·L-1磷酸緩沖液(PBS)，調節pH至7.4。

標準品溶液：分別精密稱定丹參素、原兒茶醛、p-香豆酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B 對照品4.91、5.30、1.07、1.57、2.05、1.55、2.37 mg，置于1 mL棕色量瓶中，20%乙腈-0.5%甲酸水溶液溶解，稀釋至刻度后搖勻，制成相應濃度的各標準品儲備液，4℃避光保存。分別移取相應的標準品儲備液適量，配制7個系列濃度的混合標準品溶液。

透析外液標準品溶液：分別取混合標準品溶液20 μL，40℃氮氣吹干，加入空白pH 7.4 PBS 100 μL溶解、混勻，得透析外液標準品溶液。

透析內液標準品溶液：分取混合標準品溶液20 μL，加入空白人血漿100 μL，按“2.3”項下方法處理樣品，得透析內液標準品溶液。

透析外液樣品溶液：分別向20 mL PBS溶液加入100、200、500 μL DHI，混勻，得3個濃度的透析外液樣品溶液。

透析外液單體化合物樣品溶液：根據本課題組前期含量測定結果，計算得出DHI中7種藥效物質基礎的含量，分別向20 mL PBS溶液中加入對應濃度等量的單體化合物標準品儲備液，混勻，得對應3個濃度的透析外液單體化合物樣品溶液。

2.3 樣品處理

2.3.1 透析內液樣品處理[10-11]精密移取透析內液樣品100 μL，加入20%三氯乙酸20 μL，渦旋30 s，混勻，加入乙酸乙酯200 μL，渦旋3 min，12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液150 μL，乙酸乙酯重復萃取2次，合并上清液。沉淀加入甲醇200 μL，渦旋30 s，混勻，12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液150 μL。合并上清液，40℃ N2吹干后，用100 μL 20%乙腈-0.5%甲酸水溶液復溶，渦旋30 s，混勻，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液10 μL進樣分析。

2.3.2 透析外液樣品 取透析外液100 μL，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液10 μL直接進樣分析。2.3.3 血漿蛋白結合率的測定[12]管狀透析袋預處理后，一端用棉線結扎，精密移取1 mL人血漿于袋內，袋內保留少量空氣，另一端棉線系牢，使其懸浮在盛有20 mL含DHI PBS溶液的廣口瓶中，調節透析袋內液面高度，使之與外液保持同一水平，避免透析袋貼壁，用封口膜封住瓶口，同樣操作9份，置于4℃冰箱冷藏平衡。待透析液內、外液平衡時，用10%高氯酸檢查透析外液是否有蛋白漏出，漏出者作廢。分別從未漏出蛋白的樣品中精密吸取透析內液樣本和透析外液樣本100 μL，按“2.3.1”與“2.3.2”項下操作，測定各組分濃度，按公式[13]計算蛋白結合率，其中C0為透析袋內藥物質量濃度，C1為透析外液藥物質量濃度。

3 結果

3.1 方法學考察

3.1.1專屬性 在“2.1色譜條件”下，丹參素、原兒茶醛、p-香豆酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸 B的保留時間分別約為9.20、16.90、22.46、25.82、28.25、29.89和32.10 min，內源性物質及其他成分對測定無干擾，見Fig 1。

3.1.2 線性關系

3.1.2.1 透析內液標準曲線 分別精密吸取7個系列濃度的標準品混合溶液20 μL，加入空白血漿100 μL，渦旋混勻后按“2.3.1 ”項下方法處理樣品，取10 μL進樣分析。以各成分峰面積對質量濃度進行線性回歸，得標準曲線方程，見Tab 1。

3.1.2.2 透析外液標準曲線 精密吸取7個不同濃度的混合標準品溶液20 μL，40℃ N2吹干溶劑，加入空白透析液100 μL復溶，按“2.3.2”項下方法處理樣品，取10 μL進樣分析。以各成分峰面積對質量濃度進行線性回歸，得標準曲線方程，見Tab 1。

3.1.3 準確度與精密度 按“3.1.2”項下配制低、中、高3個質量濃度的質量控制樣品：透析內液中丹參素血漿質量濃度分別為5.25、14.03、56.11 mg·L-1；原兒茶醛血漿質量濃度分別為1.89、15.14、60.57 mg·L-1；p-香豆酸血漿質量濃度分別為0.39、6.11、24.46 mg·L-1；丹酚酸D血漿質量濃度分別為0.63、8.97、35.89 mg·L-1；迷迭香酸血漿質量濃度分別為2.19、11.71、46.86 mg·L-1；紫草酸血漿質量濃度分別為1.65、4.43、17.71 mg·L-1；丹酚酸 B的血漿質量濃度分別為2.55、6.77、27.09 mg·L-1；透析外液中7種成分的血漿質量濃度分別為5.25、14.03、56.11 mg·L-1；1.89、6.06、24.23 mg·L-1；0.39、3.06、12.23 mg·L-1；0.09、1.50、5.98 mg·L-1；0.81、5.86、23.43 mg·L-1；0.33、1.77、7.09 mg·L-1；2.55、6.77、27.09 mg·L-1。考察準確度和精密度，結果見Tab 2。7種成分日內精密度RSD<12.74%，日間精密度RSD<13.54%，符合生物樣品分析要求。

Fig 1 The HPLC chromatography picture of Danhong injection in and out of dialysate

A: Blank dialysate；B: Blank dialysate+mixed standard products；C: The sample out of dialysate；D: Blank human plasma；E: Blank human plasma+mixed standard products；F: The sample in dialysate. 1：Tanshinol；2：Protocatechuic aldehyde；3：p-Coumaric acid；4：Salvianolic acid D；5：Rosmarinic acid；6：Lithospermic acid；7：Salvianolic acid B

Tab 1 Standard curves of seven components in Danhong injection

3.1.4 樣品提取回收率 精密吸取空白血漿100 μL，按“3.1.3”項下配制成低、中、高3種不同質量濃度的質控樣品，按“2.3.1”項下操作后，進樣分析；另取相應的低、中、高3個不同質量濃度對照品混合溶液各20 μL，40℃ N2吹干，100 μL 20%乙腈復溶，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液10 μL進樣分析。計算提取回收率，結果見Tab 2。

3.1.5 穩定性 按“3.1.3”項下配制的低、中、高3種濃度的質控樣品，分別考察室溫0、12、24 h，4℃冷藏保存24、48、72 h和-20℃冷凍保存7 d的穩定性。以當日標準曲線計算，各濃度樣品RSD均<12%，表明該樣品在室溫24 h、4℃冷藏72 h和-20℃冷凍保存7 d均穩定。

3.1.6 平衡時間與平衡溫度的考察 以空白透析液代替血漿，按血漿蛋白結合率的測定方法，分別于4℃和37℃放置8、12、24、48、72 h，考察3個濃度DHI的透析實驗平衡溫度和平衡時間。結果置于37 ℃的DHI 12 h后成分含量即發生變化，而放于4℃的樣品各成分均在24 h袋內外質量濃度達到平衡，故設定平衡溫度和時間為4℃和24 h。

3.1.7 透析袋吸附性考察 以空白PBS溶液代替血漿，根據公式[13]計算5、10、25 mL·L-13個濃度DHI樣品的透析袋吸附率。結果表明透析袋對藥物的吸附率小于4%，吸附微弱，且與濃度無相關性，對血漿蛋白結合率測定無明顯影響。

3.2 血漿蛋白結合率測定 根據公式[13]計算DHI中7種藥效物質基礎的人血漿蛋白結合率，結果見Tab 3。在低、中、高3種濃度條件下，丹參素等7種藥效物質基礎在DHI中及單獨給藥時的人血漿蛋白結合率見Fig 2。

Fig 2 The binding rates of human plasma of seven components in Danhong injection and alone

L，M，H：The samples of DHI in low, middle and high concentrations；L′，M′，H′：The samples of compounds alone in low, middle and high concentrations；DSS：Tanshinol；PA：Protocatechuic aldehyde；p-CA：p-Coumaric acid；SaD：Salvianolic acid D；RA：Rosmarinic acid；LA：Lithospermic acid；SaB：Salvianolic acid B.

4 討論

盡管臨床鮮有報道由血漿蛋白結合率發生變化而導致藥物相互作用，相較而言，代謝酶和轉運體導致的藥物相互作用研究更占主流，但是對于血漿蛋白結合率較高的藥物，尤其是治療窗較窄的藥物，用于治療肝腎功能損傷的患者，該參數的變化可能改變藥物體內代謝過程，應予以重視[7]。據我院2013～2014年臨床數據統計，96.65%的DHI應用患者年齡超過40歲[14]，該類患者機體功能相對減弱，并發疾病較多，聯合用藥現象十分普遍，發生藥物相互作用的幾率相對較高。DHI前期藥效物質基礎研究已經明確，通過靜脈給藥，樣品成分直接入血。本實驗研究DHI中含量較高的7種藥效物質基礎的人血漿蛋白結合率，并對比相應濃度單體化合物的人血漿蛋白結合率，結果顯示在樣品體系中各成分的血漿蛋白結合率更低，該結論與文獻[15]運用熒光淬滅法研究丹酚酸B在DHI中與單用時與牛血清白蛋白結合的差異結果相似。但只有丹參素和p-香豆酸的血漿蛋白結合率在兩種給藥環境中差異存在顯著性，這提示樣品體系內可能存在競爭性結合，但競爭并不明顯。

Tab 2 Methodology of seven compounds in Danhong injection

No．ComponentAverageplasmaproteinbindingrateinDanhonginjcetion/%Averageplasmaproteinbindingrate/%1Tanshinol11．88±0．5823．34±1．06?2Protocatechuicaldehyde78．35±1．7279．32±1．413p?Coumaricacid63．48±2．1778．97±0．08?4SalvianolicacidD87．72±0．7892．37±0．665Rosmarinicacid82．77±2．8384．95±0．386Lithospermicacid71．59±0．8179．15±5．47?7SalvianolicacidB70．55±1．3475．49±0．75

*P<0.05vsDHI group

平衡透析法作為體外測定血漿蛋白結合率的經典方法，簡便易行，結果可靠，重現性高，適用于測定結構較穩定的化合物[16]；HPLC測定含量較高的物質基礎穩定性與重現性均較為理想，故本實驗采用此兩種方法進行測定。因丹酚酸A結構不穩定，在平衡體系中24 h即發生變化，經考察后本實驗放棄同時測定丹酚酸A在樣品體系中的血漿蛋白結合率。實驗結果顯示，除丹參素外，原兒茶醛、p-香豆酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B的人血漿蛋白結合率均>60%，屬于中強型結合，與文獻報道相近。故在聯合用藥時可能會發生血漿蛋白競爭性結合，在聯合使用治療窗較窄的藥物如美托洛爾，或用于肝腎功能有損傷患者時，臨床應予以及時關注。

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Determination of binding rates of human plasma protein with seven bioactive components in Danhong injection

ZHANG Qian1,2,DAI Guo-liang1, JU Wen-zheng1, GUO Jian-ming2, SUN Bing-ting1, ZONG Yang1, HE Shu-fen1, DUAN Jin-ao2
(1.AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029,China; 2.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization,JiangsuKeyLaboratoryforHighTechnologyResearchofTCMFormulae,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,NationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine,Nanjing210046,China)

Aim To establish the method of simultaneous determination of the human plasma protein binding ratesinvitroof seven major pharmacodynamic substances in Danhong injection with HPLC. And to confirm whether the competitive effects of the multi-components exist or not through the comparasion of the plasma protein binding rates in the same concentration in or out of the Danhong injection, so as to provide the reference for the pharmacokinetics of the main bioactive substances of Danhong injection and its pharmacokinetics combined with other drugsinvivo.Methods Equilibrium dialysis method was carried out to calculate the protein binding rates in human plasma of tanshinol, protocatechuic aldehyde,p-coumaric acid, salvianolic acid D, rosmarinic acid, lithospermic acid and salvianolic acid B in Danhong injection or alone. A simple HPLC method for the determination of the concentrations of seven compounds both in inner and outer dialysis was established.Results Linear relationship, precision and accuracy, extraction recovery and stability of the seven compounds all complied with the methodology requirements.Within the low, middle and high concentration(5, 10, 25 mL·L-1) of Danhong injection, the human plasma protein binding rates of tanshinol, protocatechuic aldehyde,p-coumaric acid,salvianolic acid D, rosmarinic acid, lithospermic acid and salvianolic acid B were(11.88±0.58)%, (78.35±1.72)%, (63.48±2.17)%, (87.72±0.78)%, (82.77±2.83)%, (71.59±0.81)% and (70.55±1.34)%, respectively. While in the same concentration, the protein binding rates of the seven components were(23.34±1.06)%, (79.32±1.41)%, (78.97±0.08)%,(92.37±0.66)%, (84.95±0.38)%, (79.15±5.47)% and (75.49±0.75)%,respectively in the groups of dosed alone.There exist significant differences between the two groups of tanshinol,p-coumaric acid and lithospermic acid through thet-test, in which only the lithospermic acid depended on the concentration in this investigation.While the rest had no significant differences.Conclusions The method is simple, reliable and stable. The plasma protein binding rates of protocatechuic aldehyde,p-coumaric acid, salvianolic acid D, rosmarinic acid, lithospermic acid and salvianolic acid B are above 60% on the experimental condition. And those in the Danhong injection are lower than dosed alone. There may exist weak competitive effects of binding to human plasma protein within the multi-components in the Danhong injection. The competitive effects in multi-components can be neglected when the drug-drug interactions are influenced by the binding of plasma protein.

Danhong injection;phenolic acids; binding rate of human plasma protein; competitive binding effects of multi-components; drug-drug interactions; equilibrium dialysis method

2016-12-08,

2017-01-06

國家科技部“重大新藥創制”科技重大專項資助項目(No 2015ZX09501004001006)；江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心重點項目(No ZDXM-2-2)；江蘇省高等學校大學生創新創業訓練計劃省級項目(No 201510315064Y)

張 倩(1985-)，女，博士生，主管中藥師，研究方向：藥物相互作用，E-mail：wednesday0515@163.com； 段金廒(1956-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：中藥資源化學與方劑功效物質基礎，通訊作者，E-mail：dja@njutcm.edu.cn

時間：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.048.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.024

A

1001-1978(2017)05-0712-07

R282.71；R284.1；R977.6