抑制NF-κB的活化對免疫性肝損傷小鼠CYP3A代謝活力的影響

李學峰，郭海軍，張小謙，石素琴，王寶珍，薛永志

(1.包頭醫學院第二附屬醫院藥劑科，內蒙古 包頭 014030；2.包頭醫學院藥理學教研室，內蒙古 包頭 014060)

◇研究簡報◇

抑制NF-κB的活化對免疫性肝損傷小鼠CYP3A代謝活力的影響

李學峰1，郭海軍1，張小謙1，石素琴1，王寶珍1，薛永志2

(1.包頭醫學院第二附屬醫院藥劑科，內蒙古 包頭 014030；2.包頭醫學院藥理學教研室，內蒙古 包頭 014060)

免疫性肝損傷通常由生物因素引起，重要的特征是肝組織內大量的炎癥細胞浸潤，從而產生免疫-炎癥應答[1]。因此，現代醫學認為免疫性肝損傷的發病機制與免疫應答和免疫調節紊亂有關[2-3]。肝臟免疫系統包含眾多的固有天然免疫細胞，如巨噬細胞、NK細胞和NKT細胞。這些細胞群體大量聚集在肝臟中，能夠為機體提供抵抗外來抗原入侵的免疫監視及保護作用。如果這些免疫細胞功能表現異常，會破壞肝臟內原有的免疫平衡，從而誘發一系列的肝臟病理損傷。目前研究認為，NF-κB、CYP3A與免疫性肝損傷的發生有著密切的關系[4-5]。因此，本文通過建立免疫性肝損傷模型，考察肝臟NF-κB表達是否會影響CYP3A的代謝活力，能否通過抑制NF-κB活性降低免疫性肝損傷的程度，以期為尋找治療免疫性肝損傷的藥物提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 清潔級Balb/c小鼠(北京大學醫學部實驗動物部)：體質量20～22 g，♀，動物合格證號：SCXK(京)2007-0001；BCG凍干粉(每支60 mg，1 g·L-1)(Sigma)；BCA 蛋白分析試劑盒、ECL反應試劑盒(Pierce)；蛋白酶抑制劑(PMSF)(碧云天生物制品公司)；兔抗β-actin多克隆抗體、Cytoglobin兔多克隆抗體(Santa Cruz)；辣根酶標記的山羊抗兔IgG(中杉生物)；咪達唑侖(MDZ) 2 mL/10 mg(江蘇恩華藥業股份有限公司)。

1.2 儀器 XHP-1內切式勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；TG16-WS臺式高速離心機(湘儀離心機儀器廠)；DYY-7B型轉移電泳儀(北京市六一儀器廠)；TS-1脫色搖床(華峰儀器有限公司)；RB-200智能熱板儀(成都泰盟科技有限公司)；紫外透射反射分析儀(上海康禾光電儀器有限公司)。

1.3 動物分組及模型制備 小鼠在清潔條件下喂養2周，自由飲水進食。將50只♀小鼠稱重編號后，按隨機數字表分為Control、BCG、BCG+PDTC(50 mg·kg-1)、BCG+PDTC(100 mg·kg-1)、BCG+PDTC(200 mg·kg-1)，每組10只。BCG、BCG+PDTC(低、中、高)組尾靜脈注射125 mg·kg-114 d制備免疫性肝損傷小鼠模型，Control組尾靜脈注射等體積NS。采用NF-κB特異性抑制劑對BCG+PDTC(低、中、高)組進行干預(d 11、12、13的16 ∶00腹腔注射PDTC各1次，劑量分別為50、100、200 mg·kg-1)。d 14將小鼠頸椎脫臼處死，迅速剖取肝臟、脾臟稱重。將部分肝臟組織浸泡于事先準備好的甲醛酒精(甲醛 ∶酒精=1 ∶9)固定液中，石蠟包埋切片，常規HE染色。另稱取部分肝臟組織凍存，用于Western blot檢測。

1.4 小鼠肝組織勻漿中蛋白含量的測定 取肝臟組織切成細小的碎片，取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mmol·L-1，按照每20 mg組織加入100～200 μL裂解液的比例加入裂解液,用內切式勻漿機在冰上破碎皮層組織，直至用肉眼無法看到塊狀組織為止,然后12 000 r·min-1低溫離心15 min，取上清為蛋白樣品，置于-20℃備用。采用BCA蛋白分析試劑盒方法繪制蛋白標準曲線，保存于電腦內備用，測定樣品蛋白含量時把此標準曲線調出即可。

1.5 Western blot檢測 電泳，轉膜，封閉，Cytoglobin兔多克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體雜交，加二抗，顯色，X線片曝光，用紫外透視成像系統對X 線片進行光密度分析。

GroupLw/Bw/%ALT/U·L-1AST/U·L-1Control5．0±0．665．2±8．685．8±9．1BCG8．7±0．5?195．8±12，3??150．6±16．3??BCG+PDTC50mg·kg-18．2±1．1?172．3±15．4??143．8±14．2??BCG+PDTC100mg·kg-17．9±0．5?#145．9±13．7?#132．5±14．5?#BCG+PDTC200mg·kg-17．5±0．6?##110．1±12．7?##121．5±12．4?##

*P<0.05，**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsBCG

GroupLickthefrontfeet/timesLicktherearfeet/timesHop/timesLatentperiod/minControl22．33±2．06104．00±3．616．33±1．5319．37±0．45BCG8．00±1．00?86．00±3．00?1．67±1．1545．87±3．16?

*P<0.05vscontrol

GroupLickthefrontfeet/timesLicktherearfeet/timesHop/timesLatentperiod/minControl22．33±2．06104．00±3．616．33±1．5319．37±0．45BCG8．00±1．00?86．00±3．00?1．67±1．15?45．87±3．16?BCG+PDTC50mg·kg-112．67±6．1?89．00±2．65?2．75±0．85?33．77±0．96?BCG+PDTC100mg·kg-114．67±1．53?101．33±4．04#3．00±1．00?23．63±0．98#BCG+PDTC200mg·kg-123．33±2．52#107．00±13．11#4．00±1．73#20．87±1．98#

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsBCG

1.6 NF-κB對CYP3A活力影響的測定 動物讓其自由飲水飲食。通過稱重、編號、采用自身對照的方法，將10只小鼠置于22℃、42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃熱板上，尋找最佳刺激溫度點。MDZ 0.2 mL(2 mL/10 mg)加生理鹽水至10 mL，然后將剩余的PDTC組小鼠尾靜脈注射MDZ 0.2 mg·kg-1，相隔40 min后進行熱板法測定CYP3A代謝活力。

2 結果

2.1 PDTC對BCG誘導的免疫性肝損傷小鼠肝臟病理組織學、肝重/體重、脾重/體重、血清轉氨酶含量的影響 尾靜脈注射BCG 5～7 d 后，小鼠攻擊性增強，激惹易怒，相互撕打，嚙咬; 2周后，光鏡下觀察到肝實質及匯管區周圍有大量單核細胞及淋巴細胞浸潤，形成大小不等且彌漫性分布的大量肉芽腫團塊為特征的免疫性肝損傷，肝臟、脾臟重量明顯增大(P<0.05);血清AST、ALT 均升高(P< 0.01)。給予PDTC 進行干預，炎性細胞浸潤團塊減少，見Tab 1。

2.2 PDTC組對NF-κB的抑制作用 PDTC組NF-κB的表達明顯比BCG組、Control組少(P<0.05)。

2.3 免疫性肝損傷對小鼠肝臟CYP3A代謝活力的影響 小鼠免疫性肝損傷組明顯比空白對照組舔足次數減少，跳躍次數減少，潛伏期增加(P<0.05)，見Tab 2。

2.4 鈍化NF-κB活化對小鼠肝臟CYP3A代謝活力的影響 隨溫度升高(42℃～48℃)，舔后足次數明顯增加，存在明顯量效關系(r=0.8，P<0.01)。而舔前足次數在50℃時最多，隨溫度升高(42℃～50℃)，舔前足次數的量效關系(r=0.344，P<0.05)不如舔后足的量效關系明顯(r=0.8，P<0.01)。跳躍次數從46℃開始逐漸增加，48℃～52℃變化明顯，52℃鼠后足已經燙傷。因此認為最佳刺激溫度為48℃。

小鼠免疫性肝損傷組的舔足次數、跳躍次數明顯比Control組減少(P<0.05)，潛伏期明顯增加(P<0.05)。而PDTC組的舔足次數以及跳躍次數比BCG損傷組增加，潛伏期縮短，且呈現劑量依賴性。見Tab 3。

3 討論

本研究結果顯示，免疫損傷過程中，CYP3A表達和代謝活力下調，許多學者認為MDZ是體內CYP3A較理想的探針藥物[6-8]，它與CYP3A的底物有著良好的相關性。本文選擇MDZ作為CYP3A代謝活性的探針藥物，通過熱板實驗觀察小鼠的舔足以及跳躍反應，推測CYP3A的活力改變可能與調節NF-κB有關，通過抑制NF-κB 的活化可以上調CYP3A的活力，從而代謝MDZ能力增加，導致小鼠舔足以及跳躍次數增加。當免疫性肝損傷時，能夠產生TNF和NO，而NO作為第二信使能夠活化NF-κB，由于受到刺激NF-κB通過磷酸化、泛素化而降解，從而使NF-κB的核定位信號暴露，進入細胞核與靶基因的κB位點結合，發揮轉錄調節作用[9]。NF-κB的激活促進各種細胞因子和化學因子的基因轉錄，這些細胞因子和炎癥介質可引起肝細胞進一步壞死、凋亡、炎癥和纖維化。因此，NF-κB在免疫性肝損傷中十分重要。

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Effect of blunting NF-κB activation on CYP3A in immunological liver injury mice

LI Xue-feng1,GUO Hai-jun1,ZHANG Xiao-qian1,SHI SU-qin1,WANG Bao-zhen1,XUE Yong-zhi2

( 1.DeptofPharmacy，theSecondAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege，BaoTouInnerMongolia014030,China;2.DeptofPharmacology，BaotouMedicalCollege，BaotouInnerMongolia014060,China)

肝損傷；核轉錄因子-κB；吡咯烷烷二硫氨基甲酸；細胞色素P450 3A；小鼠；熱板法；

liver injury; NF-κB; PDTC; CYP3A;mice; hot plate

2016-12-22,

2017-01-19

國家自然科學基金資助項目(No 30760289,81460567)；內蒙古自然科學基金資助項目(No 2009MS1104,2014MS0813);內蒙古教育廳資助項目(No NJ03148，NJZY13244);內蒙古衛生廳項目(No 201302099)

李學峰(1983-)，男，碩士，主管藥師，研究方向：藥物代謝與肝臟分子藥理學，Tel:0472-3169854，E-mail: lixuefeng79@163.com; 薛永志(1968-)，男，碩士，教授，碩士生導師，研究方向：藥物代謝與肝臟分子藥理學，通訊作者,Tel：0472-7167843， E-mail:xyzhxyzh68@sohu.com

時間：2017-4-24 11:21

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1121.054.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.027

A

1001-1978(2017)05-0733-03

R-332；R322.47；R345.99；R575.02；R593.02；R977.3；R977.6