金屬硫蛋白研究進展

王文君　呂娜　尹銳　馬吉勝　李曉薇　徐赫韓　張晶

摘要：金屬硫蛋白（MT）是一類富含巰基、具有金屬結合特性的低分子量蛋白質，廣泛存在于動物、植物、微生物體內，在個體生長發育及環境適應方面發揮著重要作用。就金屬硫蛋白的來源、生理功能、檢測方法、應用前景進行綜述，為后繼的開發應用提供依據。

關鍵詞：金屬硫蛋白；來源；生理功能；應用

中圖分類號：Q51 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0013—03

金屬硫蛋白（metallothionein，簡稱MT）是分子量介于2～8 ku之間的存在于動物、微生物、植物中的一類低分子量蛋白，其中半胱氨酸占總含量的20%～30%，富含金屬（Ag、Au、Bi、Cd、Hg、Zn、Cu等），并極少含有組氨酸和芳香族氨基酸的蛋白質。金屬硫蛋白最早是Margashes和Vallee于1957年在馬腎中發現的。研究結果表明，金屬硫蛋白廣泛存在于各種微生物，高等動、植物和人類的各種組織、器官。但是目前尚未從禽類動物中分離得到金屬硫蛋白。1975年Prinz首次從釀酒酵母中分離得到Cu-MT，因其基本結構、特性和功能與哺乳動物MT類似而成為類金屬硫蛋白。1977年科學家又首次從大豆的根中分離出富含Cd²⁺的復合物，由于它在功能、性質以及柱層析上的表觀分子量與動物體內金屬硫蛋白十分相似，故將其稱為類金屬硫蛋白。第2屆金屬硫蛋白國際會議對金屬硫蛋白的具體定義作出了明確規定，將以前稱之為類金屬硫蛋白的蛋白質和動物產金屬硫蛋白統稱為金屬硫蛋白。

1金屬硫蛋白的來源及制備方法

1.1動物來源金屬硫蛋白

由于哺乳動物源的金屬硫蛋白與人的金屬硫蛋白無論是結構、活性還是功能都很相似，因此在實際生產中，主要用鎘或鋅等金屬誘兔、老鼠等動物肝臟合成，經過分離純化得到純品MT。隨著研究逐步深入，發現環毛蚓、兩棲類動物大鯢等，都可誘導產生金屬硫蛋白。環毛蚓具有富集重金屬及抗重金屬的性質，還具有蛋白質含量高、易飼養、價格低廉的特點，是生產制備MT較廉價的方法。李華利用金屬離子能夠誘導產生金屬硫蛋白性質，將鯉魚置于Cd²⁺溶液中，以誘導鎘-金屬硫蛋白的合成，通過分析，經誘導鯉魚體內產生的金屬硫蛋白性質與哺乳動物產金屬硫蛋白性質相似。

1.2植物來源金屬硫蛋白

徐振彪等摸索了一種用于玉米金屬硫蛋白的提取方法：以玉米幼苗葉片為材料，成功提取了玉米金屬硫蛋白的粗提液，該溶液在290 nm處有特征吸收峰，且經過脫金屬處理后其290 nm處特征吸收峰明顯降低，通過SDS-PAGE檢測，在分子量14 ku附近有1個單條帶，提示粗提液中含有金屬硫蛋白。這為植物金屬硫蛋白的研究奠定了基礎。

1.3微生物來源金屬硫蛋白

對微生物的研究結果表明，加入金屬離子可以使菌體內大量合成并且積累金屬硫蛋白。和使用動物肝臟提取金屬硫蛋白的方法相比，利用微生物制備金屬硫蛋白具有簡便、過程可控、生產條件要求低等優點。朱麗梅等用2.0 mmol/LCuCl₂對產朊假絲酵母進行誘導使之產生金屬硫蛋白，并測定金屬硫蛋白對羥自由基和氧自由基的清除率及對動物體的安全性。研究結果顯示，該金屬硫蛋白對羥自由基和氧自由基清除率分別達到了91.75%和83%，并且此法誘導合成的金屬硫蛋白安全無毒副作用。王巍等以基因改良過的九州蟲草真菌為菌種，采用液態深層發酵增殖菌絲體并用ZnSO₄刺激誘導其合成金屬硫蛋白，產率可達10.86 mg/g（菌絲體濕重），相較目前的傳統方法產率提高了0.1萬～1萬倍。成玉梁以優良突變株釀酒酵母N′-1為研究對象，通過優化最終確定了最佳條件，即選擇CuCl2作為誘導試劑，濃度110 mmol/L，活化培養時間48 h，誘導培養時間48 h，接種量1 mL/50 mL培養液，誘導培養基裝液量為50 mL/250 mL三角瓶，搖床轉速40 r/min。按照以上培養條件安排試驗，測得金屬硫蛋白產量（以巰基活性計）較之前的試驗有了大幅提高。張琪等探討鋅離子脅迫下蛹蟲草（Cordyceps milita-ris）金屬硫蛋白的產生及性質，蛹蟲草菌絲體以15 g/L Zn²⁺在10 L發酵罐中誘導培養56 h后收集，產率為1 L發酵液收集12.021 g菌絲體（干質量），發酵終點處金屬硫蛋白含量為12.876 mg/g菌絲體（濕重），菌絲體經提取、分離、純化，凍干得到蛹蟲草金屬硫蛋白純品。有學者通過鋅誘導小球藻分離出金屬硫蛋白，證實小球藻通過誘導的方法來產生金屬硫蛋白，為金屬硫蛋白的生產研究提供新的探索。

2金屬硫蛋白的生物學功能

2.1金屬硫蛋白對重金屬的解毒和調節作用

金屬硫蛋白的1個主要生理功能是參與生物體內必需金屬元素的調節和非必需金屬元素的解毒。在利用金屬硫蛋白基因敲除小鼠和普通野生對照小鼠研究金屬硫蛋白保護小鼠胎兒免受鎘毒作用的試驗中，發現金屬硫蛋白基因敲除小鼠的胎盤中鎘含量明顯高于野生對照鼠，原因是對照鼠懷孕期間肝臟金屬硫蛋白含量較高，降低了體內鎘的運輸。對貝類的研究結果表明，其體內Cd的積累與金屬硫蛋白有關。陸生蝸牛能忍受高濃度的Cd和Cu，是因為其中腸腺中金屬硫蛋白具有對Cd解毒功能，同時外套膜金屬硫蛋白具有cu調節功能。研究發現，甲殼動物貝類動物及魚類的體內重金屬含量也很高，試驗也證實了貝類動物和魚類動物的金屬硫蛋白存在解毒作用。

金屬硫蛋白的解毒和調節作用是有限的，重金屬元素含量超過個閾值，該種動物就會出現病理狀態，嚴重時甚至會導致種群的衰退甚至滅絕。耐污群是在生存環境受某種特別污染物污染后，動物本身經過一系列免疫調節之后重新適應的種群。在污染生存環境下，尤其是重金屬污染，耐污小種群與敏感種群的生理生態功能方面肯定具有明顯差異。但目前對耐污小種群的金屬硫蛋白基因的擴增、個體適合度的降低、細胞功能的受損、生殖力降低等方面是否與其金屬硫蛋白的解毒和調節作用有關，還有待進一步深入研究。

2.2金屬硫蛋白參與細胞調節

金屬硫蛋白的含量隨物種和發育進程的差異有所變化。大鼠、小鼠和兔等在胎兒期和剛出生時，肝臟中的金屬硫蛋白含量是最高的；而人、羊和豚鼠等在懷孕的中期或晚期金屬硫蛋白達到最大值。同時，金屬硫蛋白在細胞內的定位也與發育進程有關。在胎鼠和新生鼠的肝細胞核中，金屬硫蛋白含量高，隨后逐漸降低，2周后，金屬硫蛋白主要存在于細胞質中。金屬硫蛋白核定位的作用可能與金屬在細胞周期中與各種細胞核成分的相互作用有關。與金屬硫蛋白結合的金屬也能結合組蛋白、核RNA和核酸性蛋白，從而參與對機體發育進程的調節。金屬硫蛋白的核定位現象的發現也是認識金屬硫蛋白與細胞分化相關的一個重要基礎。在腫瘤組織中，分化程度越小則細胞核中金屬硫蛋白含量越高，金屬硫蛋白調控細胞分化主要與金屬硫蛋白結合金屬，特別是和鋅有關，金屬硫蛋白通過調節細胞內自由鋅水平而影響基因表達。

2.3金屬硫蛋白對免疫系統的調節

金屬硫蛋白對免疫系統調節的主要作用是提高極端生理刺激下生物體的存活率。金屬硫蛋白也被確定為一種阻止細胞凋亡的因子及一種重金屬螯合劑。目前，金屬硫蛋白的種類主要有MT-1、MT-2、MT-3和MT-4，可能還會有新的不斷被發現。而且不同類型的金屬與ApoMT以不同形式結合引起的影響更增加了復雜性。在考慮金屬硫蛋白在疾病中的可能作用及金屬硫蛋白對氧自由基團、線粒體及神經的作用時，可得出如下結論，高金屬硫蛋白（MT）含量可能介入疾病發生過程。Arndt-Shultz法則指出低濃度有害因子通常是激活生物過程而非抑制它們，那么金屬硫蛋白（MT）的作用就是在低濃度的金屬硫蛋白下可以協作提高鈣對ADP啟動的氧消耗的抑制作用。在無刺激的狀態下金屬硫蛋白的作用可能為提高鈣流量，低濃度的金屬硫蛋白可能在調節自由基水平上發揮作用。

2.4金屬硫蛋白的防輻射作用

金屬硫蛋白是誘導蛋白，能被多種因素誘導生成。無論是自然產生的還是誘導生成的金屬硫蛋白氨基酸組成基本相同。輻照的直接和間接作用引起機體損傷的另一個重要方面是使機體蛋白質，特別是酶受到損壞。機體受到輻照后啟動了內源金屬硫蛋白同化代謝。金屬硫蛋白含有大量巰基和低能空軌道，能有效清除多種自由基，使輻照的間接作用對機體的損傷大為減少。金屬硫蛋白中的親電巰基基團可以通過氫供體使受損的DNA得以修復。輻照引起的DNA損傷和羥自由基有關，而金屬硫蛋白是一種有效的羥自由基清除劑。金屬硫蛋白抗輻照影響作用的明確機制還有待進一步研究。

2.5金屬硫蛋白與神經系統

很多因素可影響腦內金屬硫蛋白的表達。一些重金屬離子如Cu²⁺、Zn²⁺，以及糖皮質激素和兒茶酚胺能夠調控腦內MT-1和MT-2的水平，但是這些因素都不能調節MT-3的水平，說明MT-3與MT-1、MT-2有不同的調節特點。在表達IL-6的轉基因小鼠腦內發現其小腦、腦干、下丘腦等腦組織中MT-1和MT-2含量明顯增加，說明腦內MT-1和MT-2的表達增加和小鼠炎癥有關。試驗結果表明腦內MT-1的增加能夠降低MT-3的含量，這種現象發生的原因可能是由于Zn²⁺在腦中局限性集中，繼而引發MT-3在腦內分布發生改變。此外，研究發現腦內金屬硫蛋白含量與年齡及性激素水平有密切關系，MT-1和MT-3 mRNA含量在3月齡小鼠腦中增加，在6月齡小鼠腦中減少；在試驗中觀察到，過度表達MT-1的雄性小鼠，其腦內金屬硫蛋白增加集中在小腦，而雌性小鼠各腦區金屬硫蛋白含量均增多，說明性激素對MT mRNA轉導及金屬硫蛋白表達有潛在調節作用。

3金屬硫蛋白的檢測方法

3.1 Cd/血紅蛋白親和分析法

Cd/血紅蛋白親和分析法是測定生物樣本中金屬硫蛋白含量的一種快速、靈敏、特異的方法，能對大多數生物樣品中的MT進行準確快速的評估，檢測時間短、成本低，有利于大量研究。

3.2銀染法

電泳與銀染的結合可作為檢測各種組織和培養細胞中MT的靈敏方法。這種超敏感方法可用于Cd中毒小鼠肝臟提取物和其他來自體外培養細胞提取物中MT的檢測，而且該法較經濟，不需要放射性同位素。

3.3液相色譜法

利用HPLC法將Cd誘導大鼠肝臟中的MT分離出來，直接聯于AAS后，檢測樣品中金屬含量，達到對MT定量檢測的目的，該方法具有方法簡單、靈敏度高、檢測結果準確等優點。同時，還可利用HPLC分離MT，再根據樣品對波長150 nm紫外光吸收特性來直接對MT定量。

3.4共振光散射法

通過調節激發光波長和發射光波長相等，可獲得待測組分所引起的共振光散射強度。共振光散射強度與共振光散射粒子的濃度在一定范圍內有線性關系，據此可直接進行定量分析。薛金花等利用該方法檢測了MT的含量，檢出限為19.05 ng/mL，該方法靈敏、簡便、選擇性好。

3.5競爭性酶聯免疫吸附分析

ELISA的檢測限為0.5 pg/孔，與用單克隆抗體的RIA和ELISA的檢測限60 pg/孔相比更靈敏。因此能替代RIA和單克隆ELISA，不僅能用于確定生物材料中基礎MTs水平，而且能研究MTs濃度的微小偏差。

3.6毛細管電泳

許多類型毛細管具有分析時間快（通常<15 min），樣本消耗非常小（低于nL），易于實現分析自動化等優點，能用來分離結構非常相似的蛋白。但在應用毛細管電泳技術時，必須仔細選擇最合適的分離條件和毛細管。

3.7偶聯技術

偶聯技術是快速靈敏、全面定性定量生物標本中MT亞型的一種最具吸引力的工具，未來能有效代替金屬飽合分析、免疫分析而進人生化和臨床實驗室。金屬硫蛋白在生物界中存在的廣泛性、生物作用的多樣性決定了對其精確定量的必要性。

4金屬硫蛋白的開發和應用前景

4.1金屬硫蛋白在醫藥行業的應用

金屬硫蛋白在治療癌癥、血管疾病、重金屬中毒及營養缺乏癥等方面都有很大功效。金屬硫蛋白能有效減輕放射療法的副作用，在放療過程中可保證正常細胞不受侵害，Tsu-tomu發現金屬硫蛋白具有抑制胃潰瘍形成的作用。目前，盡管金屬硫蛋白的抗病作用已經被多次證明，包括能夠阻止脂質過氧化，增強吞噬細胞的功能性，對輻射及光損傷有強烈的抵抗作用，提高免疫力，促進細胞新陳代謝等等功能，這些功能都可以由金屬硫蛋白極強的抗自由基反應解釋，但是其作用機理并沒有被完全揭開。近年來，國內外的臨床試驗證明，金屬硫蛋白對多種頑固癥、慢性病、老年病，如糖尿病、高血壓、動脈硬化、尿毒癥、老年癡呆有很強的療效。可以預料未來金屬硫蛋白在臨床醫學上將會被大量推廣應用。

4.2金屬硫蛋白在美容、護膚品行業中的應用

因為金屬硫蛋白具有強烈的抗自由基功能，所以其在美容和護膚品行業中具有極為廣泛的應用前景，前些年，國內刮過一股化妝品添加SOD的流行風，SOD作為一種抗自由基的藥物，相對于MT，只能清除O₂^-而不能清除·OH，且MT的抗氧化效果是SOD的數倍，分子量也僅為SOD的1/6，更利于皮膚的吸收。在小鼠的毒理學試驗、家兔的多次皮膚刺激試驗以及北京市疾病預防控制中心所做的人體貼斑試驗均表明，MT在皮膚表面應用時為弱致敏原，無潛在致敏原。所以在可以預見的將來，MT完全可以作為比SOD更強的抗衰老添加劑添加在化妝品中。

4.3金屬硫蛋白在保健品行業中的應用

當前社會人口老齡化嚴重，老年人越來越多，我國堅持計劃生育的國策，同時由于傳統文化的關系人們有強烈的尊老愛幼情緒，故而針對老年人和孩子的營養保健品需求極大，致使我國保健品行業快速而蓬勃地發展起來。金屬硫蛋白具有強烈的抗衰老功效以及制劑方便等特點，可制成粉劑添加到麥乳精或奶粉中，也可以制成片劑含服或制成抗衰老功能飲液，添加方便且不影響口味。隨著人們保健意識的逐步提高，金屬硫蛋白保健品將逐漸遍及中國大部分家庭，僅以口服液為例，金屬硫蛋白在國內保健品市場上甚至要比化妝品市場的前景更為廣闊。

4.4金屬硫蛋白在重金屬檢測與生物體生長環境監測中的應用

研究結果表明，生物體接觸環境中的重金屬含量和生物體體內的金屬硫蛋白含量密切相關。但是金屬硫蛋白在生物體體內的含量又不僅僅與環境中的重金屬含量有關，還與其他物理環境（如溫度、濕度）以及饑餓等相關，所以現在的研究水平還不好以生物體內的金屬硫蛋白含量來斷定環境中的重金屬含量，但是在未來，經過深入研究生物體內金屬硫蛋白濃度和生物體生長環境的關系，金屬硫蛋白必定可以應用于重金屬中毒與環境監測中。