基于UPLC—Q—TOF—MS技術的北青龍衣有效成分動態變化分析

霍金海+孫國東+董文婷+王偉明

[摘要]采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析不同采集時期北青龍衣有效成分動態變化規律。用MarkerView軟件對6個采集時期18批樣品測定數據進行主成分分析，差異性化合物通過Peakview 2.0/Masterview1.0軟件，依據精確質量數和同位素峰度比確定分子式，再通過對照品及數據庫的二級譜圖比對、裂解規律分析，結合已有文獻報道，確定結構式。結果表明不同采集期萘醌類有效成分含量發生了明顯的變化，鑒定或推斷了北青龍衣中38個萘醌類化合物結構，隨著采收時間的變化大部分萘醌類成分含量逐漸下降。該方法快速、準確，為北青龍衣的化學成分鑒定與分析提供一種新的策略，為揭示不同生長期北青龍衣有效成分動態變化規律及確定其藥材合理采收期提供基礎資料。

[關鍵詞]液相色譜-四極桿飛行時間質譜；北青龍衣；萘醌；動態變化

北青龍衣為胡桃科胡桃屬植物核桃楸Juglansmandshurica Maxim.未成熟果實的外果皮。民間多年來一直用于治療惡性腫瘤，國內外學者對其抗腫瘤活性進行了大量的報道。目前，從青龍衣中分離得到的化合物有萘醌類、黃酮類、二芳基庚烷類、萜類、鞣質類、多糖類、有機酸類及揮發油等，其中萘醌類是公認的抗腫瘤主要成分。

胡桃科Juglandaeeae共9屬71種植物，其中以胡桃楸J.mandshurica及胡桃J.regia L.作為藥用植物報道較多。但不同標準規定的藥用部位及采收時期差異較大。其中《黑龍江省中藥材標準》收載的北青龍衣為核桃楸未成熟果實的外果皮。《中藥大辭典收載》收載的核桃楸果為核桃楸的未成。“三月茵陳四月蒿，五月六月當柴燒”是古人對中藥采收期精辟的經驗總結，過季則有藥無性。尤其是果實成熟期青龍衣萘醌類成分含量極低，作為食用核桃采收時的廢棄副產品，以低廉的價格大量充斥市場，勢必影響臨床療效。

本課題組前期研究表明不同采收時期青龍衣有效成分含量差異較大，但關于不同采收時期青龍衣中胡桃醌含量變化的報道結論不一致，這可能與萘醌類成分之間相互轉化有關。單一測定一個或幾個成分的含量難以全面體現藥材的內在質量。因此，亟需一種分析手段全面反映北青龍衣不同采集時期有效成分的動態積累規律，為藥材采收期的確定提供科學依據。

超高效液相色譜（UPLC）通過在色譜柱上使用小顆粒填料以及其他部件的改進，具有更高的分離度、更快的分析速度和更大的峰容量等優點。四級桿.飛行時間串聯質譜（Q-TOF）為高分辨質譜儀，不僅具有高分辨、高選擇性的特點，通過精確的相對分子質量快速確定化合物分子式。還可以通過高低能碰撞掃描，提供豐富的二級質譜信息，再通過對照品比對及裂解規律分析，從而鑒定或推斷化合物結構。近年來，將液相色譜的高效分離能力和質譜的高靈敏度相結合，尤其是與高分辨質譜和多級質譜聯合使用的技術手段，已廣泛應用于中草藥成分的全面分析。也為研究天然產物動態積累規律開辟了全新的途徑，但該領域的研究報道較少。

本研究采用超高效液相色譜一四極桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術對不同采集期北青龍衣進行在線分離分析研究，通過化學計量學模式確定其主要化學成分變化。利用UPLC一維的保留時間鎖定化合物，通過二維的精確質量數和同位素峰度比確定分子式，再通過對照品比對或質譜裂解規律分析確定或推斷其結構式，通過有效成分動態變化分析，以期為北青龍衣的采收期的確定提供科學依據，亦為胡桃屬藥用植物萘醌類成分的質譜裂解途徑研究提供借鑒和參考。

1材料

1.1儀器

ACQUITY UPLC（美國Waters公司，包括二元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱）；ABSCEIX Triple-TOFT 5600 質譜儀（AB SCIEX，USA，配有ESI源和APCI源），數據采集軟件：Analyst TF1.6software（AB SCEIX，USA）；數據處理軟件系統：Peakview 2.0/Masterview1.0 software（AB SCEIX，USA），Markerviewl.2.1（AB SCEIX，USA）；WatersAcquity UPLC BEH C¹⁸色譜柱（2.1mmx100mm，1.7μm），AQUITY UPLC BEH C18 VanGuard Pre-Column預柱（2.1mmx5 mm，1.7μm）。

KQ-300DB型數控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA224S-CW型電子天平（賽多利斯科學儀器公司）；LGl6-W型高速離心機（北京京立離心機有限公司）。

1.2試劑

甲醇（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司），乙腈（色譜純，Merck，Germany），甲酸（色譜純，Fisher，USA），蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.3藥材與對照品

北青龍衣分別于2015年6月29日，7月15日，8月1日，8月16日，9月1日，9月15日采自哈爾濱市東北農業大學（東經126°7334.9”，北緯45°7488.6”），每采集期（1～6號采集期）以10棵核桃楸為1組樣本，共計3組。上述樣品均經初東君主任藥師鑒定為胡桃科植物核桃楸J.mandshurica的果實。剝取外果皮，通風處陰干。

胡桃醌（供含量測定用，成都瑞芬思生物科技有限公司提供，批號H-075.131230）；胡桃酮（自制，HPLC面積歸一化法測定純度>98%）。

2方法

2.1對照品溶液的制備

精密稱取胡桃醌、胡桃酮對照品適量，加甲醇制成50mg·L^-1的溶液作為對照品溶液。

2.2供試品溶液的制備

取不同采集時期北青龍衣藥材1.0g，加甲醇25mL，精密稱定，超聲處理30min（功率300w，頻率40kHz），放冷，補足甲醇，搖勻，濾過，取續濾液于一80℃凍存，分析前恢復室溫，13000r·min^-1離心10min，取上清液，即得，樣品標號為BQLY。