荷葉對高脂高糖致NAFLD大鼠炎癥因子水平及AdipoR2表達(dá)的作用研究

楊丹虹+樓招歡+程斌+張光霽+汪洋鵬+徐浩

[摘要]荷葉是“藥食兩用”中藥材，具有降脂功效。為觀察LL對高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝（NAFLD）的作用及可能的作用機(jī)制，該實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料加飲用果糖溶液建立NAFLD大鼠模型，造模同時(shí)灌胃給予荷葉混懸液，血生化儀及EⅡsA法檢測血清ALT，AsT，cr，BuN，TNF-a，IL-6，INS，GLU，ADPN，LEP及肝組織NF-KB，TGF水平；HE染色進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查；RT-PCR，Western blot法檢測肝組織AdipoR2 mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，荷葉能顯著降低模型大鼠血清ALT，AST，IL-6水平及肝組織NF-KB，TGF水平，升高脂聯(lián)素水平，增加肝組織AdipoR2蛋白的表達(dá)，改善肝細(xì)胞脂變。提示，荷葉對高脂高糖致NAFLD具有保護(hù)作用，該作用與促進(jìn)AdipoR2表達(dá)，改善胰島素抵抗，降低炎癥因子表達(dá)水平，抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]荷葉；非酒精性脂肪肝；炎癥；胰島素抵抗

隨著社會(huì)的發(fā)展及生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）發(fā)病率逐年上升，且有低齡化趨勢，已是當(dāng)前全球范圍重要的公共健康問題。現(xiàn)有西藥療效單一，且存在不同程度的毒性和不良反應(yīng)；中醫(yī)藥防治NAFLD具有良好的療效和獨(dú)特的優(yōu)勢，發(fā)展前景廣闊。荷葉是睡蓮科植物蓮的葉，含有槲皮素等黃酮類成分、荷葉堿等生物堿類成分。以往研究表明，荷葉總生物堿、荷葉黃酮具有降脂減肥、抑制肝脂質(zhì)沉積等作用，含荷葉組方制劑具有確切的抗非酒精性脂肪肝作用，但是單味荷葉抗非酒精性脂肪肝病的作用研究鮮有報(bào)道。隨著荷葉列入“藥食兩用的中藥材”目錄，荷葉粉在食品、保健食品中的應(yīng)用也日益增多，相應(yīng)的藥理作用等基礎(chǔ)研究也日益迫切。本文擬在前期研究基礎(chǔ)上，觀察新鮮荷葉經(jīng)特殊工藝制成的天然超細(xì)粉末對高糖高脂誘導(dǎo)的NAFLD大鼠炎癥因子及胰島素抵抗相關(guān)因子表達(dá)水平的影響，探討荷葉對NAFLD的防治作用及可能機(jī)制，為進(jìn)一步荷葉粉相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

1材料

1.1動(dòng)物SD大鼠，SPF級，雄性，體重180～200g，28只，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證0012051，許可證號(hào)SCXK（浙）2014-0001。于室溫（23±2）℃，相對濕度50%～70%飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.2藥物及試劑荷葉粉由杭州沃亞生物科技有限公司提供，臨用前取荷葉粉適量，用純水配置成60 g·L^-1的混懸液，即得。陽性對照藥：易善復(fù)（多烯磷脂酰膽堿膠囊，賽諾菲醫(yī)藥公司），臨用前用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為13.68 g·L^-1。高脂飼料委托浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心制備。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT），天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST），尿素氮（BUN），肌酐（CR）試劑盒購自寧波美康生物科技股份有限公司；考馬斯亮藍(lán)試劑盒（批號(hào)20150109）購自南京建成生物工程研究所；大鼠腫瘤壞死因子-a（TNF-a），白介素6（IL-6），轉(zhuǎn)化生長因子（TGF），核錄因子KB（NF-KB），葡萄糖（GLU），胰島素（INS），瘦素（LEP），脂聯(lián)素（ADPN）ELISA試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3儀器ACCUTE TBA40FR全自動(dòng)生化分析儀（東芝三廠醫(yī)療株式會(huì)社）；Power Wave 340酶標(biāo)儀（美國Bio-TEK公司）；Mx3005P熒光定量PCR儀（美國Agilent Stratagene）。

2方法

2.1分組與給藥大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，稱定體重，禁食12h后眼眶靜脈叢采血，測定血清中TC，TG水平，根據(jù)TC，TG水平隨機(jī)分為4組：正常對照組、模型對照組、陽性對照組（易善復(fù)136.8 mg·kg^-1）、荷葉組（600 mg·kg^-1），每組7只。除正常對照組外，其余大鼠均定量給予高脂飼料和10%果糖水，連續(xù)18周。自造模第1天起，除正常對照組和模型對照組灌服蒸餾水外，其余各組分別灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，每日1次，灌胃容積為0.01mL·g^-1，連續(xù)18周。

2.2一般行為學(xué)觀察每日觀察各大鼠進(jìn)食、毛發(fā)、糞便、活動(dòng)、死亡情況。

2.3血液樣本制備于實(shí)驗(yàn)第18周，末次給藥后禁食不禁水12 h，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，下腔靜脈采血，3 500 r·min^-1離心10min，取血清，備用。

2.4肝組織樣本制備采血后迅速分離肝臟，冰生理鹽水洗凈血漬，取肝右葉組織，中性福爾馬林固定，供肝組織病理學(xué)檢查用；取同部位肝組織約0.5g，加入預(yù)冷的0.9%生理鹽水4.5 mL，在冰水浴中高速分散器充分研碎，3500r·min^-1離心10min，取上清液，即為10%肝組織勻漿，備用；另取同部位肝組織適量置凍存管內(nèi)，加入RNA-later液置4℃冰箱24h后，置-80℃冰箱保存，供RT-PCR和West-ern blot檢測。

2.5胰島素抵抗相關(guān)因子水平檢測

全自動(dòng)生化分析儀測定GLU水平，ELISA法測定血清INS，LEP，ADPN水平，具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。胰島素抵抗指數(shù)IRI、胰島素敏感指數(shù)ISI的計(jì)算：采用穩(wěn)態(tài)模型（HOMA）胰島素抵抗計(jì)算法，計(jì)算公式如下：IRI=（FIN×FPG）/22.5；ISI=1/（FINxFPG）x100%。

2.6炎癥因子水平檢測

ELISA法檢測血清TNF-a，IL-6及肝組織TGF，NF-KB表達(dá)水平，具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.7肝組織AdipoR2 mRNA表達(dá)水平檢測

采用熒光定量PCR檢測。取-80℃冰箱保存的肝組織，總RNA提取試劑盒提取肝臟組織總RNA，DNase I 37℃消化5min，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄總RNA，獲得cDNA，熒光定量PCR檢測表達(dá)水平。Primer5和DNAman軟件設(shè)計(jì)AdipoR2基因的定量PCR引物，actin為內(nèi)參（引物序列信息見表1）：定量PCR反應(yīng)條件：94℃1 min；95℃10 s，58℃10s，72℃10 s（40個(gè)循環(huán)）。