西瑞香素半乳糖化脂質體在大鼠體內組織分布的研究

顏紅+歐陽婷+楊瓊梁+向彪+夏新華

[摘要] 研究西瑞香素半乳糖化脂質體在大鼠體內的組織分布。按劑量10mg·kg^-1給予健康sD大鼠單劑量尾靜脈注射西瑞香素溶液、西瑞香素普通脂質體、西瑞香素半乳糖化脂質體，分別于給藥5，15，30，45，60，120，240，360 min后采集大鼠全血和心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、腦、胸腺組織，采用HPLC測定血漿和各組織中西瑞香素的濃度。對比3組制劑，結果發現在不同時刻單位質量肝臟中西瑞香素的含量均以西瑞香素半乳糖化脂質體組為高；所有時間點西瑞香素半乳糖化脂質體對肝臟的靶向指數DTI值均大于西瑞香素普通脂質體，西瑞香素半乳糖化脂質體在肝組織的AUC和C分別為西瑞香素溶液的2.23，5.22倍。表明西瑞香素半乳糖化脂質體能夠在肝臟部位濃集，具有顯著的肝臟靶向性。

[關鍵詞]西瑞香素；半乳糖化脂質體；肝靶向；組織分布

西瑞香素，化學名為7-羥基-6-甲氧基-3，7-.雙香豆素酯，為香豆素類化合物，廣泛存在于豆科、瑞香科及蕓香科等種屬植物中。文獻報道西瑞香素對人肺腺癌細胞AGZY-83-a，人喉癌細胞Hep2，人肝癌細胞HepG2均有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性。此外，西瑞香素還有抗炎鎮痛和抗病毒等生物活性，但該藥物在水中溶解度差，在一定程度上限制了其應用。脂質體是一種可將藥物包封于類脂質雙分子層形成的薄膜中間所得的超微型球體載體，具有保護藥物、降低藥物毒性、提高制劑穩定性等優點。本試驗在將西瑞香素制備成脂質體的基礎上，研究西瑞香素半乳糖化脂質體在大鼠體內心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、腦和胸腺等組織的分布特性，為其進一步研究開發與臨床應用提供參考依據。

1材料

Agilent 1200型高效液相系統（美國安捷倫公司，包括G1311A型泵、G1314B型紫外檢測器、G1329A自動進樣器）；Thenn0 hypersil BDS色譜柱（4.6mmx250mm，5 Ixm）（美國Therm0）；WH-2微型旋渦混合儀（上海楚定分析儀器有限公司）；ZEN3600納米粒度及電位分析儀（英國Malvern公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華有限公司）；Sonic Dismembrator Model 500超聲波細胞粉碎機（美國Fisher Scientific公司）；FM70A制冰機（意大利Grant公司）；ZEN3600納米粒度及電位分析儀（英國Malvem公司）；YY/T0657-2008立式高速冷凍離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；TD6臺式低速自動平衡離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；可調式移液器20—200，200～1 000 IxL（大龍醫療設備有限公司）；BTl25D分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；氮氣吹干儀（自制）；一次性使用無菌注射器（圣光醫用制品有限公司）；玻璃勻漿器（海門市華凱實驗玻璃儀器有限公司）；SK2200HP超聲波清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）。

西瑞香素（中國食品藥品檢定研究院，含量99.4%，批號111758-201101）；補骨脂素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110739-201115）；0.9%氯化鈉注射液[回音必集團（江西）東亞制藥有限公司]；大豆磷脂Lipoid S100（德國Lipoid公司）；膽固醇（SIGMA公司）；磷酸鹽緩沖劑（粉劑，0.01 mol·L^-1，pH 7.4，北京鼎國生物技術有限責任公司）；二甲亞砜（DMSO，北京鼎國生物技術有限責任公司）；1，2.丙二醇、乙醇為生化級，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

健康SD大鼠，雄性，體重（300±20）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物合格證號4300470000565 1。

2方法與結果

2.1色譜條件

Therm0 hypersil BDS C₁₈色譜柱（4.6mmx250mm，5μm）；流動相甲醇-0.2%磷酸（41：59）；流速1.0 mL·min_-1；檢測波長346 nm；柱溫30℃；進樣量20μL。

2.2溶液的配制

西瑞香素對照溶液：精密稱定西瑞香素對照品2.5mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度為100 mg·L_-1的西瑞香素儲備液。精密量取上述西瑞香素儲備液適量，分別置于10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成西瑞香素質量濃度分別為0.20，0.50，1.0，2.0，5.0，10，20 mg·L_-1的系列對照溶液。

補骨脂素內標溶液：取補骨脂素2.5mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度為100 mg·L_-1的內標儲備液。精密量取內標儲備液1mL，置25mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成4.0 mg·L_-1的內標溶液。

2.3樣品的制備

西瑞香素溶液（DAP）的配制：精密稱定西瑞香素8.0 mg，依次加入12μL DMSO，2 mL丙二醇，2mL生理鹽水，超聲溶解，即得2.0 g·L_-1的西瑞香素溶液。

西瑞香素普通脂質體（DAP-LP）的制備：采用乙醇注入法，精密稱取磷脂、膽固醇、西瑞香素（10：2.5：1），溶于無水乙醇中（水浴加熱），所得的類脂溶液用細孔徑注射器緩慢勻速地注入到恒溫55℃，pH 7.4的10 mL磷酸鹽緩沖液中，注入過程中用磁力攪拌器攪拌，先通氮氣除去乙醇，再繼續攪拌30min，45℃孵育20min，冰浴超聲4min（工作30 s，間隔30 s），過0.45，0.22μm微孔濾膜，即得。

西瑞香素半乳糖化脂質體（Gal-DAP-LP）的制備：除在無水乙醇中加入10%的半乳糖配體外，其他步驟同上。

2.4組織生物樣品的處理

取大鼠各組織臟器，除小腸和胃剪開去除內容物后用生理鹽水清洗外，其余器官用生理鹽水洗凈表面浮血，濾紙吸干，置一20℃冷凍保存。測定前取出組織樣本，解凍后稱質量，剪碎，置于玻璃勻漿器中，加2倍量生理鹽水在冰浴中研成勻漿，制成組織勻漿液。分別取各組織勻漿500μL，置于10 mL離心管中，精密加入內標補骨脂素溶液（4.0 mg·L_-1）50μL，渦旋30秒，加入乙腈1mL，渦旋5min，再加入醋酸乙酯5 mL，渦旋混合5 min，以12000r·min_-1。離心5min，取上清液，N，吹干（40℃水?。?，殘渣加色譜甲醇100μL，渦旋5 min，以12 000r·min_-1離心5min，吸取上清液置內襯管中，即得。

2.5方法學驗證

2.5.1專屬性考察取大鼠各空白組織勻漿，除不加內標溶液外，其余按2.4項下方法處理，獲得空白組織色譜圖；將一定濃度的西瑞香素對照品溶液和內標溶液加入大鼠空白組織勻漿中，同法操作，獲得空白組織加西瑞香素與內標色譜圖；取大鼠給藥后的各組織勻漿，同法操作，獲得給藥后大鼠各組織色譜圖，各組織臟腑中色譜圖見圖1。從色譜圖可以看出，西瑞香素與內標物（補骨脂素）的色譜峰與相鄰色譜峰分離良好，西瑞香素和內標物的保留時間分別約為22.1，14.8 min。組織中內源性物質及代謝物對測定不產生干擾。

2.5.2線性關系的考察取大鼠空白組織勻漿各500加入西瑞香素系列對照溶液50，配制成相當于西瑞香素組織質量濃度為0.020，0.050，0.10，0.20，0.50，1.0，2.0 mg·L_-1的樣品溶液，精密加入內標補骨脂素溶液（4.0 mg·L_-1）50，按2.4項下方法處理，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖和峰面積，以西瑞香素在樣品中的質量濃度C（mg·L_-1）為橫坐標，西瑞香素與內標物峰面積比值K為縱坐標，進行線性回歸，得到回歸方程見表1。結果表明，西瑞香素在0.020～2.0mg·L_-1內線性關系良好。

2.5.3精密度和提取回收率試驗用空白組織配制含西瑞香素低、中、高（0.05，0.5，2.0 mg·L_-1）3

由表2，圖3，4可見，西瑞香素溶液組在不同時刻單位質量肺中西瑞香素的含量明顯高于其他臟器（P<0.01）；而3組制劑在不同時刻單位質量肝臟中西瑞香素的含量均以西瑞香素半乳糖化脂質體組為高；且西瑞香素普通脂質體組、西瑞香素半乳糖化脂質體組單位質量肝臟中西瑞香素的含量明顯高于其他臟器，與其他組織比較差異有顯著性（P<0.01）。西瑞香素半乳糖化脂質體尾靜脈注射5min后，藥物在肝臟中的含量最大，隨著時間延長，個濃度的組織樣品，按2.4項下方法處理，按2.1項下色譜條件測定，考察低、中、高濃度的日內、日間精密度和提取回收率。結果顯示，高、中、低3種濃度不同組織勻漿樣品的日內RSD≤3.8%，日間RSD≤4.3%（n=5），提取回收率均在85.0%～100%，RSD≤5.7%（n=5），均符合生物樣品測定要求。

2.6大鼠體內的組織分布考察

2.6.1大鼠尾靜脈注射3種制劑的體內分布試驗及結果取120只SD雄性大鼠，體重（300±20）g，隨機分成24組，每組5只，給藥前禁食12 h，自由飲水。分別按劑量10 mg·kg_-1尾靜脈注射DAP，DAP-LP，Gal-DAP-LP。分別于給藥后5，15，30，45，60，120，240，360 min時間點處死大鼠，立即解剖采集心、肝、脾、肺、腎等組織。按2.4項下方法處理，制備組織勻漿。按2.1項下測定分析，計算每克組織中的藥物量（由于大鼠各組織的質量不均等，比較藥物在大鼠體內組織分布時需分析各臟器每克組織的藥物含量）。3種制劑大鼠肝臟的藥物含量經時分布圖見圖2，大鼠靜脈注射西瑞香素溶液、西瑞香素普通脂質體、西瑞香素半乳糖化脂質體在不同臟器中的經時分布情況分別見表2，圖3，4。肝臟中的量逐步降低，6 h后西瑞香素半乳糖化脂質體組肝臟中藥物量為0.51μg·g_-1，而西瑞香素普通脂質體組、西瑞香素溶液組分別為0.45，0.18μg·g_-1。以上結果表明將藥物制成脂質體后改變了藥物在體內的組織分布，增加了藥物在肝臟的含量，且經半乳糖配體修飾的脂質體其肝靶向效果更強。

2.6.2肝靶向性初步評價分別采用靶向指數DTI，相對攝取率和峰濃度比，將靶向制劑

靶向指數表示給予靶向制劑后時刻組織或器官的藥物量表示給予非靶向制劑后時刻組織或器官的藥物量），靶向指數DTI可用于比較不同制劑對某器官趨向性的差異。

相對攝取率表示給予靶向制劑后求得的I組織或器官藥時曲線下面積；AUC表示給予非靶向制劑后求得的I組織或器官藥時曲線下面積），AUC根據梯形法計算。

峰濃度比表示給予靶向制劑后I組織或器官的峰濃度C2表示給予非靶向制劑后I組織或器官的峰濃度）。

以上結果表明，相比于西瑞香素溶液，西瑞香素普通脂質體（除60min時間點）、西瑞香素半乳糖化脂質體的肝DTI值均大于1，表明脂質體比藥物溶液易于濃集于靶器官——肝臟。所有時間點西瑞香素半乳糖化脂質體對肝臟的DTI值均大于西瑞香素普通脂質體，如5min時西瑞香素普通脂質體、西瑞香素半乳糖化脂質體的肝DTI值分別為3.3，5.2，表明西瑞香素半乳糖化脂質體對肝的靶向性更強。

西瑞香素普通脂質體在肝組織的AUC和C分別為西瑞香素溶液的1.49，3.34倍，而半乳糖化脂質體在肝組織的AUC和C分別為西瑞香素溶液的2.23，5.22倍，說明其對肝的選擇性更強，表明西瑞香素半乳糖化脂質體比西瑞香素普通脂質體具有更好的肝靶向性。

3討論

本試驗建立了大鼠組織中西瑞香素藥物濃度測定的HPLC方法，考察了西瑞香素溶液、西瑞香素普通脂質體、西瑞香素半乳糖化脂質體在大鼠體內的組織分布及對肝臟的靶向性。建立的HPLC可靠、穩定，各臟器回收率均在85.0%～100%，符合生物樣品測定要求。

西瑞香素溶液、西瑞香素普通脂質體、西瑞香素半乳糖化脂質體3種制劑經大鼠尾靜脈注射后，測定藥物在大鼠體內的組織分布。結果顯示3組制劑在不同時刻單位質量肝臟中西瑞香素的含量均以西瑞香素半乳糖化脂質體組為高；且西瑞香素半乳糖化脂質體組單位質量肝臟中西瑞香素的含量明顯高于其他臟器，與其他組織比較差異有顯著性（P<0.01）。采用靶向指數DTI，相對攝取率峰濃度比為評價參數，相比于西瑞香素溶液，西瑞香素半乳糖化脂質體對肝的DTI值均大于1，西瑞香素普通脂質體除60 min時間點外，其他均大于1，且所有時間點西瑞香素半乳糖化脂質體對肝臟的DTI值均大于西瑞香素普通脂質體。西瑞香素普通脂質體在肝組織的AUC和分別為西瑞香素溶液的1.49，3.34倍，而半乳糖化脂質體在肝組織的AUC和C分別為西瑞香素溶液的2.23，5.22倍，表明藥物經脂質包封后對肝臟具有一定的靶向效應，而半乳糖配體的引入可進一步提高脂質體對肝臟的靶向性。