土家藥白頭婆成分及含量研究△

龔星軍 溫 曉 魏媛媛 田 蘭 張?jiān)? 谷利民 胡 杰

(1.湖南張家界市人民醫(yī)院，湖南 張家界 427000；2．吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000；3.湖南湘西州民族醫(yī)藥研究所，湖南 吉首 426000)

方藥縱橫

土家藥白頭婆成分及含量研究△

龔星軍1溫 曉2魏媛媛2田 蘭3張?jiān)?*谷利民1胡 杰1

(1.湖南張家界市人民醫(yī)院，湖南 張家界 427000；2．吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000；3.湖南湘西州民族醫(yī)藥研究所，湖南 吉首 426000)

本文對(duì)湖南產(chǎn)的土家藥白頭婆進(jìn)行初步研究，結(jié)果顯示，白頭婆含有豐富的黃酮類、蛋白質(zhì)與Ca類化合物，Pb、Cd、Hg等元素未檢出。

土家族藥；白頭婆；成分分析；檢測(cè)

白頭婆Eupatorium japonicum Thunb.被子植物門(mén) Magnoliophyta雙子葉植物綱 Magnoliopsida 菊目 Asterales 菊科 Asteraceae 澤蘭屬Eupatorium，為多年生草本植物，卵圓形或披針形葉子對(duì)生，邊緣有粗齒，下面有柔毛和腺點(diǎn)；秋季開(kāi)白色管狀花，頭狀花序多數(shù)，在枝端排列成傘房狀；瘦果有柔毛和腺點(diǎn)。主要分布于我省及武陵山脈周邊等高山盆地，尤常見(jiàn)于密疏林下、灌叢中、山坡草地、水濕地和河岸水旁，目前尚未由人工引種栽培。白頭婆原載昆明植物研究所中國(guó)高等植物數(shù)據(jù)庫(kù)全庫(kù)、中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。全國(guó)第四次中藥資源普查武陵山區(qū)均有分布，民間藥用常呼別名為山蘭、孩兒菊、神仙草、不老草等。

本品全草入藥，味苦、辛，性平，祛暑發(fā)表、化濕和中、理氣活血、化瘀、行水消腫，主治夏傷暑濕、發(fā)熱頭痛、胸悶腹脹、消化不良、月經(jīng)不調(diào)、跌打損傷、癰腫、蟲(chóng)蛇咬傷。土家民間用于傷科，是著名的強(qiáng)盜藥；其花泡制的藥酒還有抗衰老、延年益壽等功能。目前對(duì)白頭婆的研究從藥物成分和臨床資料均缺乏，有較大研究?jī)r(jià)值。本文對(duì)其基本成分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、礦物質(zhì)元素等進(jìn)行了檢測(cè)，以期為其開(kāi)發(fā)打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：白頭婆采自湖南省龍山縣，經(jīng)鑒定為菊科澤蘭屬植物白頭婆(Eupatorium japonicum Thunb.)帶花的全草，干燥后粉碎，過(guò)100目篩，裝瓶備用。

1.2 化學(xué)試劑：蘆丁對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)生物制品檢定所，甲醇美國(guó)Tedia公司，牛血清蛋白國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，葡萄糖隴西化工股份有限公司，L-谷氨酸購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所，水合茚三酮天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，沒(méi)食子酸國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，考馬斯亮藍(lán)G-250上海沃凱公司，蒽酮國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，硫酸、氯化亞錫、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、福林酚、三氯化鋁、氯化鉀、氯化鈉、碳酸鈣、純鎂、鐵粉、鉛粉、鎘粉、金屬銅均為光譜純；鉛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，鹽酸、氫氧化鈉為優(yōu)級(jí)純，維生素C、硅藻土、甲醇、無(wú)水乙醇、重鉻酸鉀、2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸(MES)、三羥基甲基氨基甲烷(TRIS)、石油醚(沸程30℃～60℃)、丙酮、鹽酸、硼酸、草酸、硝酸、檸檬酸、硫脲、氧化鑭、硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、活性炭、2，4-二硝基苯肼、酚酞、甲基紅、溴甲酚綠、亞甲基藍(lán)均為分析純。

1.3 儀器設(shè)備：FA224B萬(wàn)分之一天平(上海佑科儀器公司)，HH型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(江蘇金壇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)，SB-25-12DT超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，LD5-2A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，U-3900H型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)，Agilent1260 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司)，AA-680火焰原子吸收(日本SHIMADZU公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 水分：參考GB 5009.3—2010采用直接干燥法。

1.4.2 灰分：參考GB 5009.4—2010。

1.4.3 總黃酮的測(cè)定[1]：稱取0.010g蘆丁，用30%乙醇溶解并定容至100mL的容量瓶中，制成0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取剛配制好的蘆丁標(biāo)液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL置于6個(gè)50mL的容量瓶中，依次編號(hào)0～5，用65%乙醇補(bǔ)至10mL后，加入5%的NaNO21mL搖勻，靜置6min，再加入10%的硝酸鋁1mL搖勻，靜置6min，加入10mL的4%的氫氧化鈉，并用65%乙醇定容至50mL，搖勻15min后顯色置于510nm處分光光度計(jì)測(cè)吸光度。 [標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得：A=0.0217C 0.0053 r=0.9996]。

樣品測(cè)定：準(zhǔn)確稱取白頭婆樣品1.0000g粉末1.0g，置于索氏提取器中，用65%的乙醇提取3次，每次提取2h, 每次加入60mL，后經(jīng)蒸餾回收乙醇，濃縮后，用65%的乙醇定容至 50mL容量瓶中，取1mL置于50mL的容量瓶中用65%乙醇補(bǔ)至10mL后，加入5%的NaNO21mL搖勻，靜置6min，再加入10%的硝酸鋁1mL，搖勻，靜置6min，加入4%的氫氧化鈉10mL，并用65%乙醇定容至50mL，搖勻15min后顯色置于510nm處分光光度計(jì)測(cè)吸光度。測(cè)黃酮的吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線上，讀出黃酮含量。

1.4.4 總生物堿的測(cè)定[2]：稱取 5.0 mg干燥的鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解置 50 mL容量瓶中，稀釋至容量瓶的刻度線，搖勻備用。用移液管從中精密吸取5.0 mL該溶液于 25 mL的容量瓶中，加入 0.1 mol/L的鹽酸溶液并稀釋至容量瓶的刻度線，制備0.02 mg/m l的液體作為鹽酸小檗堿對(duì)照品母液。分別吸取 0.02 mg/mL 的鹽酸小檗堿對(duì)照母液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于 10 mL容量瓶中，加入 0.1 mol/L 的鹽酸溶液定容，搖勻備用，作為實(shí)驗(yàn)組，在波長(zhǎng)為 345 nm下測(cè)定其吸光值A(chǔ))。選擇等體積的 0.1 mol/L 的鹽酸溶液，作為空白對(duì)照組，在相同的條件下測(cè)定其吸光值(A)，以橫坐標(biāo)為濃度 C，縱坐標(biāo)為吸光值(A)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=0.35+1.1832C(r=0.9995)。

樣品測(cè)定：稱取白頭婆樣品粉末 200 g，采用超聲輔助法提取，功率 60 W，提取時(shí)間 30 min/次，提取 2 次，料液比(g∶mL)1∶9，提取溫度 70℃，提取劑 70%乙醇 ，合并濾液，經(jīng)石油醚去除色素，用氯仿萃取 2 次，取下層液體水浴蒸發(fā)濃縮至褐色浸膏。稱取浸膏 5.0 g 置于燒杯中，用蒸餾水溶解，置于250 mL的容量瓶中，加蒸餾水定容，制成 0.02 g/mL的液體混合均勻備用；精密吸取5.0 mL提取物溶液至 10 mL容量瓶中，加入 0.1 mol/L鹽酸溶液定容，混合均勻備用；采用二倍稀釋法得到5 mg/mL溶液，再次用紫外 - 可見(jiàn)分光光度法于345 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值(A)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總生物堿含量。

1.4.5 蛋白質(zhì)：參考GB/T 5009.5-2008采用凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.6 脂肪：參考GB 5413.3-2010 與GB/T 5009.6-2003采用石油醚索式提取法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.7 礦質(zhì)元素含量的測(cè)定[3-4]：火焰原子吸收法(GB5413.21-2010)與(GB 5413.22-2010、GB/T5009.12-2003、GB/T5009.15-2003。)

1.4.8 可溶性總糖：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：稱取105℃真空干燥至恒重的葡萄糖100mg，配成0.5mg/mL葡萄糖溶液。分別取該溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL于5個(gè)50 mL容量瓶中,用蒸餾水定容。各取以上5組溶液2mL于錐形瓶，在每支試管中立即加入蒽酮試劑8.0m1，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加蓋，以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸起，準(zhǔn)確煮沸l(wèi)0 min取出，用冰浴冷卻至室溫，在620 nm波長(zhǎng)下以第一管為空白，迅速測(cè)其余各管吸光值。以多糖濃度為橫坐標(biāo)X(mg / mL)，以吸光度為縱坐標(biāo)Y。[標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得：Y =0.1012X + 0.0083，r= 0.9991]

白頭婆中總糖的提取與測(cè)定：精確稱取0.500 g，置于50 mL三角瓶中，加水15 m1，鹽酸10 mL，沸水浴20 min，定容至100mL，得提取液。取5 mL濾液定容至50 mL。吸取2 mL已稀釋的提取液于試管中，加入4.0 mL蒽酮試劑，平行三份；空白管以等量蒸餾水取代提取液。以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。根據(jù)A620平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡萄糖的含量(μg)。

1.4.9 總氨基酸： 總氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取7個(gè)25mL容量瓶，吸取標(biāo)液0、0.5、1.0 、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于7個(gè)25 mL容量瓶，加水補(bǔ)充至容積為4 mL，然后加茚三酮和緩沖液各1 mL，于水浴加熱15 min，冷卻后定容25 mL，靜置15 min，在570 nm下測(cè)消光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。[標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得：Y =33.21X + 0.045，r= 0.9995]

樣品測(cè)定：準(zhǔn)確稱取白頭婆樣品1.0000g，置于50mL錐形瓶中，加沸蒸餾水30mL，立即置于沸水浴中，浸提45 min，期間每隔10 min搖動(dòng)一次，45 min以后趁熱真空過(guò)濾，殘?jiān)蒙倭糠兴礈?～3次，濾液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，待冷卻后加水至刻度備用。吸取濾液1 mL，置于25 mL容量瓶中，再加0.5mL緩沖液(pH=8)，加茚三酮顯色劑0.5 mL，在沸水浴中加熱15 min，待冷卻后加水定容至25 mL，放置10 min后，用波長(zhǎng)570 nm測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果

白頭婆分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 白頭婆分析結(jié)果

3 討論

3.1 從結(jié)果可以看出，白頭婆中含有較為豐富的總黃酮和生物堿等具較強(qiáng)生物活性的有效成分，其中總生物堿為1.20%，總黃酮達(dá)到了3.85%，為白頭婆臨床療效提供了理論基礎(chǔ)，其具體成分和作用有待進(jìn)一步研究。

3.2 白頭婆的其他成分中蛋白質(zhì)的含量達(dá)到了11.31%，脂肪含量不高僅為2.6%，蛋白質(zhì)含量是脂肪的4.35倍。碳水化合物含量高達(dá)53.12%。礦物質(zhì)元素中Ca的含量達(dá)27.5%，分別是Cu的2291倍、Fe的85.9倍、Na的21倍；K、Mg含量也超過(guò)5%。提示白頭婆除了藥理作用外，還有綜合利用的前景。

3.3 白頭婆中Pb、Cd、Hg等重金屬元素未檢出。提示本品應(yīng)用安全。

[1]李桂蘭，劉計(jì)權(quán),等.山西產(chǎn)金蓮花總黃酮及3種黃酮苷含量的測(cè)定[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016.31(1): 275-278.

[2] 劉燕,劉艷,馬宇穎,等.雞骨草葉總生物堿的含量測(cè)定及其體外抗氧化活性研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016.13(28):25-27、55.

[3]劉嶺,賀浪沖,梁曉聰,等.5種藥食同源中藥中重金屬元素鉛與鎘的測(cè)定[J].陜西中藥，2010.31(7):897-899.

[4]GB 5009.3-2010、GB 5009.4-2010、GB 5009.4-2010、GB 5413.3-2010、GB/T 5009.6-2003、GB5413.21-2010、GB 5413.22-2010、GB/T5009.12-2003、GB/T5009.15-2003。

2017年1月6日收稿

湖南張家界市科技項(xiàng)目2015YB007

龔星軍，男，副主任藥師。聯(lián)系方式：13974450858

R297.3

A

1006-6810(2017)03-0031-03

*通訊作者