志賀菌檢驗(yàn)技術(shù)的研究進(jìn)展分析

李福春

【中圖分類號(hào)】R373 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-6851（2017）04-0-01

志賀菌作為一種腸道傳染病菌，是經(jīng)消化道傳播，會(huì)對(duì)腸黏膜上皮細(xì)胞造成侵襲，導(dǎo)致排黏液膿血便、腹瀉、腹痛以及高熱等癥狀。相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，每年感染痢疾的人數(shù)高達(dá)1.6億人，而死亡的人數(shù)則高達(dá)1.1萬(wàn)，在死亡病例中則主要為年齡小于5歲的兒童[1]。與發(fā)達(dá)國(guó)家相比較，發(fā)展中國(guó)家的衛(wèi)生條件更差，痢疾感染率也更高，而志賀菌則是引起感染性腹瀉病的主要病原菌。所以對(duì)志賀菌進(jìn)行快速和有效的檢驗(yàn)，對(duì)于疾病的防治就顯得非常重要。

1.志賀菌生物學(xué)特征分析

志賀菌作為兼性厭氧革蘭陰性短小桿菌，無(wú)鞭毛、無(wú)莢膜、無(wú)芽胞，大部分均存在菌毛；志賀菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求較低，在普通培養(yǎng)基上就能生長(zhǎng)，而生長(zhǎng)的最佳PH值、溫度分別為7.2-7.4、37℃。志賀菌能對(duì)葡萄糖進(jìn)行分解，不產(chǎn)氣能產(chǎn)酸，尿素和V-P試驗(yàn)表現(xiàn)為陰性，不會(huì)形成硫化氫，不能利用丙二酸鹽或者檸檬酸鹽。志賀菌屬包括表面抗原和菌體抗原，通過(guò)菌體抗原能對(duì)菌型進(jìn)行區(qū)別，表面抗原則能對(duì)菌體抗原與相應(yīng)抗血清的凝集反應(yīng)進(jìn)行有效阻止。按照菌體抗原、生化反應(yīng)的差異，可以將志賀菌分為不同血清群，分別為宋內(nèi)志賀菌、鮑氏志賀菌、福氏志賀菌、痢疾志賀菌。

2.志賀菌常規(guī)檢驗(yàn)技術(shù)分析

志賀菌常規(guī)檢驗(yàn)技術(shù)的步驟主要為培養(yǎng)增菌、純化分離、生化試驗(yàn)、血清學(xué)鑒定分型，該技術(shù)作為檢驗(yàn)志賀菌的基礎(chǔ)方法，現(xiàn)階段已納入到了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，志賀菌常規(guī)檢驗(yàn)技術(shù)的全程用時(shí)一般為3-5天，檢驗(yàn)結(jié)果能對(duì)標(biāo)本的真實(shí)狀況進(jìn)行穩(wěn)定、準(zhǔn)確和直觀地反應(yīng)。在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)中，要想讓檢出率顯著提高，則可以選擇敏感性低的麥康凱、選擇性強(qiáng)的木糖賴氨酸去氧膽酸鈉（XLD）或者HE培養(yǎng)基，然而應(yīng)謹(jǐn)慎使用沙門氏菌-志賀菌分離培養(yǎng)基。法國(guó)梅里埃公司所生產(chǎn)的顯色培養(yǎng)基，其特異性和敏感性較高，能直接分離和鑒定志賀菌[2]。志賀菌常規(guī)檢驗(yàn)技術(shù)的特異性低，而且操作比較繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且要求檢測(cè)者有豐富的檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，在很大程度上依賴檢測(cè)者的專業(yè)素質(zhì)和實(shí)驗(yàn)時(shí)的工作狀態(tài)，成為檢驗(yàn)部門的一項(xiàng)沉重負(fù)擔(dān)，無(wú)法滿足快速處理的要求，對(duì)于突發(fā)公共衛(wèi)生事件的處理和大批量健康人體的體檢需求無(wú)法有效滿足。因此有必要探索更為準(zhǔn)確、快捷、有效的志賀菌的檢驗(yàn)方法。

3.志賀菌的自動(dòng)化分析儀檢驗(yàn)技術(shù)

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)快速發(fā)展的過(guò)程中，微生物檢驗(yàn)則正向著自動(dòng)化分析儀檢驗(yàn)技術(shù)的方向所發(fā)展。美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)將法國(guó)生物梅里埃公司的Vitek-Ams系統(tǒng)作為全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)方法，其基礎(chǔ)為細(xì)菌的微量生化反應(yīng)，通過(guò)儀器對(duì)微量培養(yǎng)基的發(fā)酵情況進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)，計(jì)算機(jī)按照所接收的發(fā)酵信息來(lái)?yè)Q算，同時(shí)和數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，獲得檢驗(yàn)結(jié)果。

4.志賀菌的化學(xué)鑒定技術(shù)

分析發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞壁及其內(nèi)含物中，化學(xué)分類信息比較豐富。多糖、蛋白質(zhì)、極性脂類、脂磷壁酸、脂溶性色素等也為化學(xué)分類法的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)病原菌中的弧菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬、大腸埃希菌屬進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)菌間細(xì)菌脂肪酸組成比例存在顯著差異，通過(guò)組成差別則能快速診斷病原菌[3]。

20世紀(jì)50年代以來(lái)，為了尋求快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、微量的檢驗(yàn)方法，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，從以傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)發(fā)展到以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的或以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法，并在實(shí)踐檢驗(yàn)中不斷取得新進(jìn)展[4]。

5.志賀菌的免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

5.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法作為使用最多、發(fā)展最快、應(yīng)用最早的一種檢驗(yàn)方法，是經(jīng)免疫學(xué)或者化學(xué)的方法，將免疫反應(yīng)物形成酶標(biāo)記物，并和待檢驗(yàn)樣品中的相應(yīng)抗體或者抗原結(jié)合，然后形成免疫復(fù)合物，經(jīng)水解或者酶催化后，利用酶標(biāo)儀、肉眼來(lái)對(duì)底物所產(chǎn)生的顏色進(jìn)行觀察。通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附法來(lái)對(duì)志賀菌純培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，具有較高的重復(fù)性、準(zhǔn)確度和特異性，適合用來(lái)快速檢測(cè)志賀菌，特別適合在基層進(jìn)行應(yīng)用和推廣。但是酶聯(lián)免疫吸附法的試劑具有較高的選擇性，不能對(duì)多種成分進(jìn)行同時(shí)分析，對(duì)于結(jié)構(gòu)類似的化合物存在交叉反應(yīng)，保存方法、時(shí)間、溫度、環(huán)境等因素容易對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果造成影響，所以需要輔助方法來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn)[3]。

5.2 SPA協(xié)同凝聚法

SPA是指金黃色葡萄糖球菌A蛋白，處于菌體細(xì)胞壁的表面，能非特異性結(jié)合IgG的Fc段[5]。在SPA和大量抗體結(jié)合后，能顯著提高其靈敏度，能在1-2天內(nèi)獲得結(jié)果，所以SPA協(xié)同凝聚法具有操作簡(jiǎn)單方便、靈敏、快速等特點(diǎn)，對(duì)于食品安全檢驗(yàn)和檢測(cè)工作的需求能有效滿足。

5.3 蛋白質(zhì)印跡法

蛋白質(zhì)印跡法作為蛋白質(zhì)測(cè)定技術(shù)之一，是通過(guò)特異性抗體檢測(cè)樣品中的多克隆抗體或者微量抗原來(lái)對(duì)單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)連續(xù)分析轉(zhuǎn)移到固相膜上的蛋白質(zhì)[6]。蛋白質(zhì)印跡法具有較高的敏感度和特異性，能長(zhǎng)時(shí)間保存固相膜，而且不需要對(duì)靶蛋白實(shí)施放射性核素標(biāo)志。

6.志賀菌的分子生物檢驗(yàn)技術(shù)

6.1 PCR技術(shù)

PCR作為臨床中應(yīng)用非常廣泛的一種分子生物學(xué)診斷技術(shù)，其基礎(chǔ)為核酸生物學(xué)。PCR技術(shù)的原理和DNA天然復(fù)制過(guò)程比較類似。和常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)相比較，PCR檢測(cè)志賀菌的陽(yáng)性率顯著更高，然而卻容易造成污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性，而且技術(shù)要求和檢測(cè)費(fèi)用比較高，進(jìn)而對(duì)其應(yīng)用造成一定的限制。

6.2 基因芯片

基因芯片也被稱之為DNA微陣列、DNA芯片、寡核苷酸陣列，選擇顯微打印或者原位合成手段，在支持物表面骨化DNA探針，形成二維DNA探針陣列，并和標(biāo)志物品雜交，對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而來(lái)實(shí)現(xiàn)高效、快速檢測(cè)生物樣品。基因芯片技術(shù)具有較高的敏感性和特異性，而且操作簡(jiǎn)單方便，自動(dòng)化分析結(jié)果，進(jìn)而來(lái)有效防止人為因素所引起的錯(cuò)誤。

6.3 基因探針

基因探針是通過(guò)人工合成的方式，從微生物中制備DNA片段，對(duì)其進(jìn)行純化，然后將熒光物質(zhì)、生物素、同位素等標(biāo)記上，形成具有特異性的DNA探針，對(duì)待測(cè)樣品和標(biāo)志性DNA探針間有無(wú)雜交分子進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而來(lái)對(duì)樣品中有無(wú)目標(biāo)微生物進(jìn)行判斷。采用基因探針技術(shù)能對(duì)DNA核酸序列點(diǎn)突變進(jìn)行準(zhǔn)確和直接的分析，然而假陽(yáng)性卻比較長(zhǎng)，和常規(guī)PCR檢測(cè)相比較，基因探針技術(shù)的檢驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，不適合用于快速檢測(cè)。

除此之外臨床中常用的分子生物檢驗(yàn)技術(shù)還包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)（PFGE）以及聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)等。

7.小結(jié)

在我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展的過(guò)程中，食品安全衛(wèi)生檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)也越來(lái)越高，采用便捷、準(zhǔn)確和快速的檢驗(yàn)技術(shù)也就顯得越來(lái)越關(guān)鍵。現(xiàn)階段臨床中在對(duì)志賀菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可供選擇的方法較多，各種檢驗(yàn)方法也均具有各自的優(yōu)點(diǎn)和不足，在實(shí)際的檢驗(yàn)中，應(yīng)結(jié)合檢驗(yàn)的實(shí)際要求來(lái)選擇合理的檢驗(yàn)技術(shù)，進(jìn)而來(lái)保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)：

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