Tris-Hcl提取法提取鹿茸蛋白質工藝的研究

蔡文君，趙文海*，楊春輝

（長春中醫藥大學，吉林 長春 130117）

Tris-Hcl提取法提取鹿茸蛋白質工藝的研究

蔡文君，趙文海*，楊春輝

（長春中醫藥大學，吉林 長春 130117）

目的本試驗以鹿科動物梅花鹿（Cervus Nippon Temminck）的雄鹿未骨化密生絨毛的幼角為試驗材料，優選Tris-HCl提取法的最佳工藝，并考察其對鮮鹿茸與干鹿茸對提取率的影響。方法采用正交試驗法，以鹿茸蛋白含量為評價指標，考察溫度，時間，物液比，pH值等對提取工藝的影響；采用所得的最優條件，對同等質量的干茸及鮮茸的提取率進行比較。結果Tris-Hcl法提取鹿茸蛋白的最優條件為緩沖液pH值為8，提取時間為10 min，料液比為1:12，提取溫度為20℃；鮮茸作為提取基質效果明顯優于使用干茸提取鹿茸蛋白質。結論本研究第一次使用Tris-Hcl法提取鹿茸蛋白質，豐富了鹿茸蛋白的提取方法，通過對比鮮鹿茸與干鹿茸的提取效果，更加明確了選材基準，為后續的研究，打下堅實的基礎。

鮮鹿茸、鹿茸蛋白、Tris-HCl提取法、正交試驗

鹿茸首載于《神農本草經》，列為中品。《本草綱目》記載“鹿茸，生精補髓，養血益陰，強筋健骨”。具有壯腎陽，益精血，強筋骨，調沖任，托瘡毒的功效，用于治療陽痿滑精、宮冷不孕、畏寒、眩暈、耳鳴腰脊冷痛、漏帶下等癥[1]。

現代藥理學研究表明，鹿茸的組成成分復雜，最新發現的肽類物質為鹿茸活性成分之一。鹿茸多肽由促進細胞有絲分裂活性劑促進細胞分裂的作用，可促進

傷口愈合，提高免疫力，抗氧化、抗炎等多方面的藥理活性。作為生長因子類藥物，具有促進神經再生，加快神經軸突生長速度，有助功能恢復，加速創傷愈合功能[2]。鹿茸多肽提取時緩沖液多為酸性或中性鹽，且緩沖液pH值不同，提取率也不同[3-6]。Tris-HCl提取蛋白法為首次用于鮮茸蛋白的提取，本實驗采用Tris-HCl提取的方法，對梅花鹿鹿茸中的蛋白質進行提取分離，并采用正交試驗設計考察不同提取溫度，提取時間，物液比，及Tris-HCl法的pH值等，以期優選出Tris-HCl法提取梅花鹿茸蛋白質的最佳提取工藝。

1.Tris-HCl法提取梅花鹿鮮鹿茸蛋白質

1 材料與方法

1.1.1 儀器

Sigma臺式高速冷凍離心機3k15，imark酶標儀、FDU-1200冷凍干燥機、手持式勻漿機，十萬分之一分析天平。

1.1.2 試劑與材料

牛血清蛋白（購于中國藥品生物制品檢定所）、Folin酚試劑、Lowry試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）、Tris-Hcl緩沖溶液（自制）。

1.1.3 鹿茸蛋白質的提取

將梅花鹿二杠鹿茸鮮品使用切片機切成薄片，剔除邊緣絨毛，用預冷的蒸餾水反復沖洗至無血色后稱重，手持式勻漿機12000r/min反復勻漿，勻漿過程中不斷添加勻漿液（Tris-Hcl緩沖溶液，p H8.0）；離心（12000r/min，30 min，4℃），取上清液。除鹽后凍干，得到鹿茸蛋白質粗提物，-20℃保存。

1.1.4 鹿茸多肽含量的測定

1.1.4.1試劑準備 將 5mg/mL的BSA標準蛋白用蒸餾水稀釋為0.1 mg/mL；樣品用蒸餾水做適當稀釋為1 mg/mL，0.1 mg/mL兩個稀釋度；根據標準品和樣品計算所需的工作液，溶液A：B為1：50，充分混勻。

1.1.4.2標準曲線的建立

1）準備22個微量離心管，設置重復管號0-10，按表一配置BSA濃度梯度的標準溶液；

2）各離心管加入1 L的反應工作液，混勻，室溫下靜置10 min；

3）各離心管加入10ul的Folin酚試劑，迅速混勻，室溫下靜置30 min；

4）酶標儀上測量各離心管中的A750值，以標準品不同梯度的BSA測定的A750值為縱坐標，對應蛋白濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2 Tris-HCl法提取工藝正交試驗設計

查閱參考文獻[7-9]，通過預實驗篩選的結果，選取Tris-HCl緩沖液pH值（A），提取時間（B），料液比（C），提取溫度（D）這4個因素，每個因素設3個水平，試驗因素水平分配見表1。

表1 正交試驗因素水平表（n，%）

結果表明，影響多肽提取率的因素按其影響程度的大小分別為緩沖液pH值（A）＞提取時間（B）＞料液比（C）＞提取溫度（D）；緩沖液pH值對鹿茸蛋白提取率有顯著性差異，因為蛋白質帶電荷，當緩沖液pH值發生改變時，有的蛋白質會發生等電點而沉淀，導致多肽含量降低，因此選擇緩沖液pH8為最佳濃度。而料液比對多肽的提取影響較小，因為當料液比為1：8時，Tris-Hcl緩沖液中的蛋白質含量基本達到飽和，料液比再增加也不會提高多肽的提取率。而提取溫度對蛋白質提取的影響最小。所以，正交試驗的最優條件為A3B1C3D2，由結果可知即緩沖液pH值為8，提取時間為10 min，料液比為1:12，提取溫度為20℃最優。

2 鮮鹿茸與干鹿茸提取率對比

2.1 方法

選取相同質量的鮮鹿茸與干鹿茸各100 g，使用選取的最優Tris-HCl提取法提取梅花鹿鹿茸蛋白，即以緩沖液pH值為8，提取時間為10 min，料液比為1:12，提取溫度為20℃的最優提取條件為基準，分別進行勻漿-離心-透析-凍干，然后通過Lowry試劑盒對蛋白含量進行測定。

2.2 結果

在相同的提取條件下，測得鮮鹿茸的蛋白含量為23.54%，干鹿茸中的蛋白質含量為17.31%。由此可見，提取鹿茸蛋白質時以鮮茸作為提取基質效果明顯優于使用干茸提取鹿茸蛋白質。

3 結 論

Tris-Hcl法提取鹿茸蛋白質的條件以緩沖液pH值為8，提取時間為10 min，料液比為1:12，提取溫度為20℃最優。

提取鹿茸蛋白質時以鮮茸作為提取基質效果明顯優于使用干茸提取鹿茸蛋白質。

近年來，鹿茸中蛋白質的研究以呈現出白熱化的趨勢，而蛋白質的提取是所有研究中的基礎與前提，本研究第一次使用Tris-Hcl法提取鹿茸蛋白質，豐富了鹿茸蛋白的提取方法，通過對比鮮鹿茸與干鹿茸的提取效果，更加明確了選材基準，為后續的研究，打下堅實的基礎。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫藥科技出版社,2015:323-324.

[2] 陶榮珊,胡太超,李金偉,等.鹿茸多肽提取分離純化及藥理作用研究進展[J].經濟動物學報,2014,18(4):238-242.

[3] 嚴銘銘,曲曉波,鐘英杰,等.梅花鹿鹿茸中促進海馬神經細胞增殖蛋白的分離純化[J].中草藥,2007,38(8):1163-1167.

[4] 李銀清.梅花鹿茸膠原的分離提取及活性研究[D].長春:長春中醫藥大學,2007.

[5] 王 豐,梅子青,周秋麗,等.鹿茸多肽的分離純化及藥理活性[J].吉林大學學報:理學版,2003,41(1):111-114.

[6] 劉瑞江,張業旺,聞崇煒,等.正交試驗設計和分析方法研究[J].實驗技術與管理,2010,27(9):52-55.

[7] 劉明磊.正交試驗設計中的方差分析[D].東北林業大學,2011.

[8] 盛永莉.正交試驗設計及其應用[J].濟南大學學報(綜合版),1997(3):69-73.

[9] 段海生.Tris-Hcl法提取蝶類干標本蛋白質的研究[J].江大大學學報:自然科學版,2010,38(2):64-67.

本文編輯：王雨辰

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ISSN.2095-8242.2017.010.1959.02

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