褪黑激素抗氧化作用的研究進展

邊小娜+張家新

摘 要：褪黑素對氧化應激反應的降低非常有效。它通過活性氧和活性氮物質的直接解毒手段實現這種作用，也可以間接通過結合褪黑素受體刺激抗氧化酶同時抑制促氧化酶的活性，或者螯合涉及Fenton / Haber-Weiss反應的過渡金屬離子，減少破壞性毒性羥基自由基的形成，導致氧化應激的減少。在降低氧化應激能力方面，褪黑素的代謝產物也具有類似的功能。褪黑素在細胞內的普遍存在但不均等的分布，包括其在線粒體中的高濃度，可能有助于其抵抗氧化應激和細胞凋亡的能力。該文就褪黑激素的抗氧化作用研究進展作簡要綜述。

關鍵詞：褪黑激素；抗氧化；自由基

中圖分類號 R96 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）09-0024-04

Abstract：Melatonin is uncommonly effective in reducing oxidative stress under a remarkably large number of circumstances. It achieves this effect via direct detoxification of reactive oxygen species and active nitrogen substances. It can bind to the melatonin receptors which indirectly stimulate antioxidant enzymes and chelate transition metals which are involved in the Fenton/Haber-Weiss reactions；in doing so，melatonin reduces the formation of the devastatingly toxic hydroxyl radical resulting in the reduction of oxidative stress. The metabolic products of melatonin also have similar functions in reducing oxidative stress. Melatonin's ubiquitous but unequal intracellular distribution，including its high concentrations in mitochondria，likely aid in its capacity to resist oxidative stress and cellular apoptosis. In this paper，the progress of anti-oxidation of melatonin is briefly reviewed.

Key words：Melatonin；Antioxidant；Free radical

褪黑激素（melatonin，MT）是一種由哺乳動物松果體分泌的吲哚類激素，具有調節情緒、睡眠、免疫、性行為、生殖及晝夜節律等多種生理功能。近年來研究表明，褪黑激素對衰老、腫瘤生長、慢性病以及老年病的發生和發展起著重要的調節作用。20世紀90年代初，Tan等[1]首次報道MT具有抗氧化作用，是一種高效的內源性自由基清除劑，能有效清除羥自由基、過氧亞硝基陰離子等活性氧。許多研究表明，MT的抗氧化作用是其抗衰老、預防老年病、預防慢性病發生的重要因素。

褪黑激素（melatonin，MT），是一種由松果腺分泌的吲哚類激素，其化學名稱是N-乙酰基-5-甲氧基色胺。吲哚環上存在5-甲氧基和N-乙酰基，這兩個基團是MT清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）的必需基團，其中5-甲氧基可以在生理狀態下極大的增強MT捕獲自由基的能力，且N-乙酰基可以保護MT不被單胺氧化酶降解。此外，MT結構穩定，沒有游離的巰基和羥基，自身不容易發生氧化還原反應。MT是完全依賴向親電子中間體和部分還原的缺電子生物大分子提供電子而發揮其抗氧化效應[2]，也就是說MT是提供電子來清除ROS的抗氧化劑。

1 褪黑素——調節其它抗氧化酶的活性

抗氧化物酶活性在正常光照下呈現內源性節律。隨著時間的推移，這些周期性的改變可能取決于褪黑激素的晝夜節律。將動物暴露于恒定光照下，消除內源性褪黑激素節律性變化，發現該動物的抗氧化物酶活性夜間上升的現象消失。這說明褪黑素生理水平的變化足以改變抗氧化防御體系。眾所周知，讓動物連續暴露于光照下可以使其夜間褪黑素不再升高，這與雞的幾個組織中GSH-Px和SOD活性在夜間增加減少相關[3]。在其他嚙齒動物也有類似的發現，由松果體切除術引起的褪黑激素缺乏可降低大鼠幾種組織中的GSH-Px活性水平[4]。添加外源性褪黑素可以使大鼠和雞的組織中GSH-Px、SOD的活性增強[5-8]。機體內褪黑激素的改變可以使抗氧化酶活性改變。

尹華祺探究了褪黑素對熱應激小鼠的抗氧化作用，發現熱應激時小鼠的總抗氧化能力、SOD酶活、GSH-Px酶活都降低，而MDA含量升高，這說明熱應激已對小鼠的抗氧化體系造成損害，而褪黑素抗熱應激的小鼠總抗氧化能力、SOD酶活、GSH-Px酶活均高于小鼠的生理水平，MDA含量則低于小鼠的生理水平，這表明了褪黑素能降低機體由熱應激引起的氧化損傷[9]。代國杰發現褪黑素可以顯著降低小鼠因脂多糖（LPS）導致的機體的ROS水平，提高機體的T-AOC水平，增強了機體抗氧化物酶SOD、GSF-Px的活性，提高機體的抗氧化能力[10]。洪汝濤、陳世林等人用褪黑素處理急性酒精性肝損傷大鼠，發現褪黑激素能顯著升高抗氧化物酶SOD的活性，增強急性酒精性肝損傷大鼠的抗氧化能力[11]。當機體處于氧化應激條件時，外源性褪黑素可以是機體內抗氧化酶的活性和表達升高，以更好地保護機體免受自由基的氧化損傷。

有研究發現在多巴胺能神經元細胞系中添加褪黑激素，褪黑激素可以誘導合成一些新蛋白，而這些蛋白可以調節3種抗氧化酶Cu/ZnSOD，MnSOD和GSH-Px基因的表達。同時褪黑激素也使編碼Cu/ZnSOD和GSH-Px的mRNA的半衰期減少，而不改變編碼MnSOD的mRNA的半衰期[12]。這表明，培養基中的褪黑素可能誘導產生更多具有較短半衰期的mRNA的水平即前兩種酶。最后，納摩爾濃度的褪黑激素足以誘導抗氧化基因表達。如上所述，褪黑激素受體參與抗氧化酶基因表達調控的可能性極高。

顏賽梅通過培養Muller細胞，研究褪黑素及褪黑素受體調節抗氧化酶活性的作用機制，發現與正常生理條件相比較，高糖條件下Muller細胞的褪黑素膜受體（MT1/MT2）基因的表達量顯著升高。同時發現在高糖條件下，細胞中核因子2相關因子（Nrf-2）和亞鐵血紅素氧化酶（HO-1）的表達量在添加褪黑激素組的表達量顯著高于不添加褪黑素組，同時在細胞培養液中添加褪黑激素和褪黑激素受體拮抗劑luzindole與僅添加褪黑激素相比較，細胞中核因子2相關因子（Nrf-2）和亞鐵血紅素氧化酶（HO-1）的表達量顯著減低[13]，這說明褪黑激素通過與褪黑激素受體結合，調控細胞內NRF-2因子，從而調控HO-1的活性。Nrf-2是一種重要的抗氧化因子，可以結合抗氧化反應元件（ARE）誘導大部分內源性抗氧化系統蛋白的表達，如亞鐵血紅氧化酶（HO-1）、硫氧化還原蛋白、谷胱甘肽（GSH）等，實現體內氧化還原的再平衡。蛋白激酶C磷酸化Nrf-2可能是其轉錄增加的關鍵步驟，對于氧化應激敏感的蛋白激酶途徑，如MAPKs家族中的ERKs和P38等可能參與Nrf-2與抗氧化反應元件（ARE）的結合。褪黑素與褪黑素受體結合，活化Gq蛋白，激活質膜上的磷脂酶C，使質膜上PIP2水解成IP3和DAG。IP3與內質網上的IP3配體們鈣通道結合，開啟鈣通道，使胞內鈣離子濃度升高，胞內高濃度的鈣離子和DAG可以激活蛋白激酶C（PKC），活化的PKC可以調節MAPK家族，從而調節抗氧化物酶的表達。

2 褪黑素——螯合重金屬鹽離子

盡管銅對于細胞生理是必需的，但當它處于高濃度時，它可以參與產生羥基自由基的Fenton/Haber-Weiss反應。由于細胞質內抗氧化酶銅超氧化物歧化酶（CuSOD）減少，導致銅的缺乏從而減弱了抗氧化防御進程。此外，一些神經疾病的共同特征是銅和/或其他金屬的過量，其中包括阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、和肝性關節退化（Wilson病），這些條件中的一些相關的分子損傷可能是過量銅離子的促氧化作用的結果，所以調節銅等金屬離子的水平與細胞需要一致是極為重要的。在1998年，使用吸收伏安法作為評估方法，Limson等[14]報道了褪黑激素可以結合鋁，鎘，銅，鐵，鉛和鋅，就像金屬硫蛋白。褪黑素與這些金屬的相互作用是濃度依賴性的。褪黑激素參與芬頓反應的形式為螯合鐵2+和鐵3+。如果鐵與蛋白質例如血紅蛋白結合，褪黑激素可以將4價鐵如血紅蛋白氧化鐵蛋白還原回3價鐵，從而重新構建蛋白質的生物活性。這將類似于褪黑激素在遇到高毒性羥基時的還原作用。尤其是在大腦中，由于金屬硫蛋白是蛋白質，金屬產生的自由基會損害過渡金屬與金屬硫蛋白形成的任意結合鍵，使得金屬硫蛋白在過渡金屬結合方面起著較不重要的作用。相比之下，在大腦中褪黑素中和所產生的自由基并減少氧化損傷顯得尤其重要。相對于血液中的濃度，CSF中高水平的褪黑激素可以為腦提供額外的氧化應激保護的可能性[15]。在腦中，褪黑激素除了其直接清除活性和間接抗氧化作用，可以替代或補充金屬硫蛋白作為過渡金屬的主要粘合劑。

Parmar等[16]研究了褪黑素降低肝臟勻漿中銅介導的脂質過氧化的能力。在這項研究中，褪黑激素可以通過直接清除足夠的毒性自由基引發脂質過氧化降低脂質損害；通過電化學研究發現褪黑素結合Cu2+和Cu+，這些功能可能會降低肝臟脂質的氧化。Mayo等[12]研究發現褪黑素可以降低由Cu2+/H2O2引起的蛋白質損傷，而在比較研究中，Gulcin等人[17]發現褪黑激素具有比α-生育酚或合成抗氧化劑丁基化羥基丁基苯甲醚或丁基化羥基甲苯更高的Fe2+螯合活性。褪黑素還顯著減少Al3+，Zn2+，Cu2+，Mn2+和Fe2+與淀粉樣蛋白β肽的相互作用[18]。

在最近褪黑激素的金屬螯合活性相關的研究中，發現褪黑激素結合銅離子時產生穩定的復合物有兩種機制，直接螯合機制（DCM）和偶聯去質子化螯合機制（CDCM）。在生理條件下，預測CDCM是Cu2+螯合的主要途徑[19]。褪黑激素螯合Cu2+并完全抑制Cu2+/抗壞血酸混合物中誘導的氧化應激。褪黑激素也阻止了Fenton/Haber-Weiss反應中的初始步驟，從而降低了氧自由基的形成。在生物體中會發生金屬催化產生分子損傷，褪黑素有螯合這些有害離子的能力。

3 褪黑素代謝產物抗氧化

褪黑激素的直接自由基清除活性已確定25a了。該過程的后續報告還確定了當褪黑素清除兩種自由基時形成的一種新的褪黑素代謝物—環-3-羥基褪黑素C3OHM。研究發現C3OHM及其下游代謝物N-乙酰基-N-甲酰基-5-甲氧基神木胺（AFMK）和N-乙酰基-5-甲氧基神經胺（AMK）都是褪黑素的抗氧化相關物，他們以及褪黑素都可以減緩分子，細胞和組織，包括人類細胞的氧化損傷[20-22]。因此，褪黑激素的第一代，第二代和第三代代謝物都已被證明是極好的自由基清除劑。褪黑激素的這些級聯產物可能使其能夠清除多達10種自由基產物，這與對單個氧化分子解毒的經典自由基清除劑形成鮮明的對比。

研究發現褪黑激素以及其代謝物C3OHM，AFMK和AMK都具有螯合銅的能力，降低氧化應激。通過比較褪黑激素、C3OHM、AFMK和AMK的螯合銅能力，發現褪黑激素及其代謝物結合銅離子機制是一樣的[23]，在生理條件下，預測CDCM是Cu2+螯合的主要途徑。褪黑激素及其代謝物螯合Cu2+并完全抑制Cu2+/抗壞血酸混合物中誘導的氧化應激[19]。類似地，褪黑激素、C3OHM和AFMK阻止了Haber-Weiss反應中的初始步驟，從而降低了氧自由基的形成。在這些發現的基礎上，褪黑激素除了作為自由基清除級聯反應中的初始分子，也參與金屬螯合級聯反應[24]，從而降低機體內由金屬離子引起的氧化損傷。

4 褪黑素——線粒體的靶向抗氧化劑

在正常需氧細胞中，線粒體發生氧化磷酸化產生大量ATP供細胞正常所需外，也產生大量的活性氧，與此同時細胞中也有一些常規的抗氧化劑來抵消ROS。但是這些常規的抗氧化劑不能在線粒體中大量存在，如內源性輔酶Q10和維生素E。為實現他們在線粒體中的大量存在，輔酶Q10和維生素E需要與親脂性焦磷酸磷銨素陽離子（TPP）共軛[24，25]。TPP與Q10或維生素E的共軛物MitoQ或MitoE可以快速穿過細胞和線粒體膜，并且結合的物質在線粒體積聚的濃度比未結合的抗氧化劑高達幾百倍。而褪黑素可以自由快速穿過線粒體膜，在線粒體中發揮直接抗氧化功能。Lowes等人比較了褪黑素與兩種線粒體靶向抗氧化劑MitoQ和MitoE在減少氧化損傷中的相對作用，發現這3種物質在減少氧化損傷和抑制促炎細胞因子方面具有相同的保護作用[26]。褪黑素可以像MitoQ和MitoE一樣快速穿過細胞和線粒體膜，并且在線粒體中積聚結合的的濃度比常規的抗氧化劑高達幾百倍，是線粒體的靶向抗氧化劑。這將與褪黑素水平在肝線粒體中比血漿線粒體中高得多結果一致[27，28]，這與線粒體可能是細胞內褪黑激素合成的位點的設想一致[29]。褪黑素在線粒體中的定位可能是其強抗氧化活性的的關鍵。

褪黑素對氧化應激反應的降低非常有效。它通過活性氧和活性氮物質的直接解毒手段實現這種作用，也可以間接通過結合褪黑素受體刺激抗氧化酶同時抑制促氧化酶的活性，或者螯合涉及Fenton/Haber-Weiss反應的過渡金屬離子，減少破壞性毒性羥基自由基的形成，導致氧化應激的減少。在降低氧化應激能力方面，褪黑素的代謝產物也具有類似的功能。褪黑素在細胞內的普遍存在但不均等的分布，包括其在線粒體中的高濃度，可能有助于其抵抗氧化應激和細胞凋亡的能力。

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