補腎強筋膠囊含藥血清對IL-1β刺激的人原代軟骨細胞的影響

姚楠， 陳能， 許學猛， 黃雪君， 蔡大可， 劉文剛

（1廣東省中醫藥工程技術研究院／廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東 廣州510095；2廣東省第二中醫院 骨科，廣東 廣州510095；3廣州中醫藥大學 研究生院，廣東 廣州510405）

補腎強筋膠囊含藥血清對IL-1β刺激的人原代軟骨細胞的影響

姚楠1， 陳能2,3， 許學猛2， 黃雪君1， 蔡大可1， 劉文剛2

（1廣東省中醫藥工程技術研究院／廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東 廣州510095；2廣東省第二中醫院 骨科，廣東 廣州510095；3廣州中醫藥大學 研究生院，廣東 廣州510405）

目的 研究補腎強筋膠囊含藥血清對IL－1β刺激的人原代軟骨細胞的影響。方法 采用IL－1β（10 ng／mL）刺激人原代軟骨細胞，并且加入不同濃度的補腎強筋膠囊含藥血清處理24 h。然后用格式試劑法和酶聯免疫法分別檢測軟骨細胞上清液中NO和PGE2水平，采用RT－qPCR檢測軟骨細胞COX－2、iNOS、MMP－1、MMP－13、TIMP－1 mRNA表達。結果 補腎強筋膠囊含藥血清可明顯降低軟骨細胞NO和PGE2水平，并顯著降低COX－2、iNOS、MMP－1、MMP－13 mRNA表達，而對TIMP－1 mRNA表達無明顯影響。結論 補腎強筋膠囊含藥血清對IL－1β刺激的人原代軟骨細胞有一定保護作用，其作用機制與降低COX－2、iNOS、MMP－1、MMP－13 mRNA表達有關。

補腎強筋膠囊含藥血清；白介素-1β；軟骨細胞

膝骨關節炎 （knee osteoarthritis，KOA）是全球范圍內最常見的與老齡化相關的退行性關節病，嚴重影響患者的生活質量，同時給其家庭及社會均帶來沉重的負擔。骨關節炎在我國傳統醫學中屬于 “痹證”、 “骨痹” 的范疇。 中醫理論認為，KOA的病機特點包括 “腎虛血瘀”、 “腎虛絡阻”等，并且絕經后婦女的中醫辨證多屬 “腎虛”， “補腎活血法”成為了中醫治療該病的大法。本課題組許學猛教授在中醫整體觀和辨證論治的觀點指導下提出治療KOA的主要原則是補腎活血、活血通絡、祛風除濕，進而根據該原則篩選中藥組成補腎活血膠囊 （后更名為補腎強筋膠囊）。方中選用杜仲、補骨脂、骨碎補進行補肝腎、強筋骨，熟地滋陰補腎，這四藥共為君藥，血竭活血通絡為臣藥，另外以全蝎祛風除濕、通絡止痛為佐藥，六藥合用有強筋壯骨、活血通絡之功。該方為院內制劑，目前已通過臨床試驗以及分子實驗證實了該方對膝骨關節炎具有良性干預作用［1-2］，但其在細胞水平上的調節作用機制尚不明確。因此，本實驗采用IL－1β誘導退變的軟骨細胞，研究補腎強筋膠囊含藥血清對IL－1β刺激的軟骨細胞NO和PGE2含量，以及對COX－2、iNOS、MMP－1、MMP－13和TIMP－1 mRNA表達的影響，從分子水平探討其治療膝骨關節炎的作用機制，現將結果報道如下。

1 材料

1.1 儀器電子分析天平 （德國Sartorius公司）；5424型小型高速離心機（德國 Eppendorf公司）；-80℃ 超低溫冰箱 （美國Thermo公司）；IQTM5型熒光定量PCR儀 （美國Bio-Rad公司）；SmartSpec plus核酸蛋白測定儀 （美國 Bio-Rad公司）；Milli Q Plus超級純水儀 （美國Millipore公司）；HH-6數顯恒溫水浴鍋 （金壇市富華儀器有限公司）；Varioskan Flash型全波長多功能酶標儀 （美國Thermo公司）；ClassⅡType B2型生物安全柜 （新加坡Esco公司）；CO2細胞培養箱 （美國Thermo公司）；Cellometer Mini自動細胞計數儀 （美國Nexcelom公司）；DMI8倒置熒光顯微鏡 （德國Leica公司）。

1.2 藥物和試劑補腎強筋膠囊由廣東省第二中醫院制劑室提供；高糖DMEM培養基、胎牛血清、胰酶和DPBS（美國Gib co公司）；總RNA提取試劑Trigol（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（美國 Thermo公司）；MaximaTMSYBR Green／Fluorescein qPCR Master Mix（2×） （美國Thermo公司）；特異性引物 （上海英濰捷基貿易有限公司）；NO檢測試劑盒 （碧云天生物技術有限公司）；人PGE2ELISA試劑盒 （美國R＆D公司）；氯仿、異丙醇、無水乙醇均為國產分析純。

2 方法

2.1 補腎強筋膠囊含藥血清制備取SPF級 SD雌性大鼠15只，其中 10只為給藥組，分別按高、低劑量 （0.486 g生藥／kg、0.243 g生藥／kg）各灌胃5只；5只為正常對照組，不給藥，用等體積生理鹽水灌胃。所有大鼠連續灌胃7 d，最后1次給藥后1 h，大鼠腹主動脈取血，3 000 rpm離心5 min，取上清液，56℃、30 min滅活，經0.45 μm濾膜抽濾除菌，分裝，-80℃保存備用，即為空白血清及高、低兩種濃度的含藥血清。

2.2 細胞培養和造模選取本單位骨科手術室行膝關節置換手術的絕經后女性患者（年齡＞65歲）的軟骨，迅速轉移至細胞培養室，在超凈工作臺用眼科剪切取軟骨組織，越細越好，至6 mm3大小的碎塊，放入培養皿，加 DPBS溶液清洗 2次，5 min／次，除去上清后加入0.25%胰酶消化30 min，然后吸棄上清液，加入0.02%Ⅱ型膠原酶于37℃、5%CO2培養箱內消化過夜。消化后將細胞懸液用 100 μm細胞濾網過濾，加入含10%FBS的高糖DMEM培養基終止消化，1 000 rpm離心5 min，棄上清，細胞沉淀用含10%FBS的高糖DMEM培養基培養，每天在倒置熒光顯微鏡下觀察生長情況，每2天換液1次，待軟骨細胞鋪滿瓶底后，用0.25%胰酶進行消化和傳代，傳代后繼續用含10%FBS的高糖DMEM培養基培養。用IL-1β刺激軟骨細胞作為體外KOA模型。將培養的第二代的人軟骨細胞按每孔 3×105個細胞種植于6孔板，培養至細胞融合度達到約80%時，吸棄培養基，用DPBS洗2次后，分為四組：正常對照組只添加細胞培養液 （高糖DMEM培養基＋10%大鼠空白血清）；模型對照組添加細胞培養液 （高糖DMEM培養基 ＋10%大鼠空白血清），并加入10 ng／mL IL-1β；含藥血清高、低劑量組：添加細胞培養液 （DMEM培養基＋10%大鼠高或低濃度含藥血清），并加入10 ng／mL IL-1β。以上各組細胞設3個復孔，繼續培養24 h后收集各組細胞以及上清液。

2.3 細胞上清液NO和PGE2的檢測根據試劑盒說明書要求，分別檢測細胞上清液的NO和PGE2含量。

2.4 基因表達的檢測首先采用Trigol、氯仿和異丙醇等試劑提取軟骨細胞總 RNA，然后采用 RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit提供的實驗方法進行反轉錄操作，其中加入上述提取的總RNA，合成First-strand cDNA。引物設計利用Primer 6.0生物軟件，基因的引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成。設計的引物信息如表1所示。

表1 擴增的基因引物信息

將9.5 μL滅菌超純水、1 μL cDNA、特異性引物 F和 R（終濃度均是1 μM）各1 μL、MaximaTMSYBR Green／Fluorescein qPCR Master Mix（2×）12.5 μL混合后共25 μL放入定量PCR儀進行擴增。步驟如下：①94℃，5 min；②94℃，30 s；55℃，40 s；72℃，50 s（45個循環）；③72℃，7 min。反應結束后，記錄Ct值，運用2-△△Ct法計算各組基因相對表達量。

2.5 統計學分析采用SPSS 17.0軟件，所有結果以均數 ±標準差 （±s）表示。多組間均數比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。組間均數兩兩比較，方差齊時采用SNK法，方差不齊時采用Dunnett's T3法，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 補腎強筋膠囊含藥血清對軟骨細胞NO和PGE2含量的影響模型對照組軟骨細胞上清液中NO和PGE2含量明顯高于正常對照組 （P＜0.01）；與模型對照組比較，補腎強筋膠囊含藥血清高、低劑量均能顯著降低軟骨細胞上清液中NO和PGE2含量 （P＜0.05）。見表2。

表2 各組軟骨細胞NO和PGE2的含量比較 （±s）

表2 各組軟骨細胞NO和PGE2的含量比較 （±s）

注：與模型對照組比較，＆P＜0.01，*P＜0.05；與正常對照組比較，＃P＜0.01。

組別 n NO（μmol／L） PGE2（pg／mL）含藥血清高劑量組 3 6.27±0.40＆ 272.46±7.92＆含藥血清低劑量組 3 8.13±0.88* 305.38±8.18＆模型對照組 3 12.06±1.96＃ 330.71±12.95＃正常對照組 3 1.28±0.21 70.46±8.44

3.2 補腎強筋膠囊含藥血清對軟骨細胞相關基因mRNA表達的影響與正常對照組比較，模型對照組軟骨細胞的COX-2、iNOS、MMP-1、MMP-13 mRNA表達均明顯升高 （P＜0.05），而TIMP-1 mRNA表達明顯降低 （P＜0.05）；與模型對照組比較，補腎強筋膠囊含藥血清高和低劑量均顯著降低了COX-2、iNOS、MMP-1、MMP-13 mRNA表達 （P＜0.05），但對TIMP-1 mRNA表達無明顯影響 （P＞0.05）。見表3。

表3 各組軟骨細胞相關基因mRNA表達比較 （±s）

表3 各組軟骨細胞相關基因mRNA表達比較 （±s）

注：與模型對照組比較，＆P＜0.01，*P＜0.05；與正常對照組比較，＃P＜0.01。

基因 n 含藥血清 含藥血清 模型對照組 正常對照組高劑量組 低劑量組COX-2 3 6.81±0.83＆ 7.92±0.91* 10.48±1.53＃ 1.00±0.24 iNOS 3 4.88±0.42＆ 5.43±0.70* 6.23±1.45＃ 1.00±0.27 MMP-1 3 3.90±0.52* 4.30±0.45* 5.44±0.69＃ 1.00±0.48 MMP-13 3 3.73±0.48＆ 5.57±0.86* 9.41±1.67＃ 1.00±0.49 TIMP-1 3 0.67±0.06 0.68±0.08 0.62±0.18＃ 1.00±0.30

4 討論

膝骨關節炎 （KOA）自發病早期開始，其病理變化主要為關節組織的炎癥伴隨不同程度的退變，在這個過程中，有許多炎性細胞因子的參與，其中IL-1是炎性致病機制的決定因子之一［3］，它主要通過增加基質金屬蛋白酶 （MMP）的合成和一氧化氮 （NO）的釋放，參與關節軟骨的退變降解過程。而阻斷IL-1β的產生則能夠快速且持續地降低大部分自身炎性疾病［4］的嚴重程度。

一方面，MMP家族在KOA軟骨細胞外基質的降解中發揮重要作用，其中MMP-1和MMP-13是MMP家族中非常重要的兩種酶，它們在很大程度上對膠原蛋白的降解產生影響［5-6］。而基質金屬蛋白酶組織抑制劑 （TIMP）能夠抑制MMP酶活性，調節MMP酶發揮正常的功能，兩者共同維護細胞外基質穩態。當MMP與TIMPs之間的平衡被打破后，就會引發KOA。另一方面，氧化應激也是導致KOA發生和發展的重要原因。IL-1β能夠刺激iNOS和COX-2的表達，分別增加NO和PGE2的含量［7-10］，最終導致MMPs的表達上調［11-12］，進而MMP與TIMPs之間的平衡被打破，最終誘發和加重KOA。

關于補腎強筋膠囊組方中所含的單味中藥，王勝楠［13］的研究發現，杜仲苷可抑制IL-1β刺激的軟骨細胞分泌iNOS、COX-2、MMP-3、MMP-9和MMP-13。王毅等［14］的研究發現，含骨碎補的藥物血清可降低IL-1β刺激的軟骨細胞MMP-3／TIMP-1水平。

本實驗結果顯示，與模型對照組比較，補腎強筋膠囊含藥血清能夠明顯降低IL-1β刺激下軟骨細胞上清液中NO和PGE2的含量 （P＜0.05），并且降低軟骨細胞COX-2、iNOS、MMP-1和MMP-13 mRNA表達 （P＜0.05），而對TIMP-1 mRNA無明顯影響 （P＞0.05），提示其治療KOA的機制可能與其緩解炎癥、抑制軟骨細胞外基質降解進而保護軟骨有關。本實驗結果雖與上述單味中藥研究結果具有相似性，但由于中藥復方具有復雜性，其作用機制仍有待進一步的深入研究。

綜上所述，本實驗從細胞水平初步探討了中藥補腎強筋膠囊在體內入血后干預KOA的可能機制，即補腎強筋膠囊含藥血清對IL-1β刺激的人原代軟骨細胞有一定的保護作用，其作用機制與降低COX-2、iNOS、MMP-1、MMP-13 mRNA表達有關，為闡明該藥治療KOA的作用機制奠定了一定的基礎。

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（責任編輯： 常海慶）

Effect of Bushenqiangjin Capsule-Contained Serum on Interleukin-1β-Stimulated Human Chondrocytes

YAO Nan1,CHEN Neng2,3,XU Xuemeng2,HUANG Xuejun1,CAI Dake1,LIU Wen'gang2
(1Guangdong Province Engineering Technology Research Institute of TCM/Guangdong Provincial Key Laboratory of Research and Development in Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510095,China;2Department of Orthopedics,Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital,Guangzhou 510095,China;3Graduate School,Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China)

Objective To study the effect of Bushenqiangjin capsule-contained serum on interleukin-1β(IL-1β)-stimulated human chondrocytes.Methods The cultured human chondrocytes were treated with IL-1β(10 ng/mL)in the presence or absence of different concentration of Bushenqiangjin capsule-contained serum for 24 h.Nitric oxide(NO)and prostaglandin E2(PGE2)levels of cell culture supernate were assessed by Griess reaction and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)respectively,mRNA expressions of cyclooxgenase-2(COX-2),inducible nitric oxide synthase(iNOS),matrix metalloproteinase-1(MMP-1),matrix metalloproteinase-13 (MMP-13)and tissue inhibitors of metalloproteinase-1(TIMP-1)in chondrocytes were detected by RT-qPCR.Results Bushenqiangjin capsule-contained serum significantly reduced the NO and PGE2levels,also the mRNA expressions of COX-2,iNOS,MMP-1 and MMP-13. No obvious effect was found on the TIMP-1 mRNA expression in IL-1β-stimulated human chondrocytes.Conclusions Bushenqiangjin capsule-contained serum has certain protective effect on IL-1β-stimulated human chondrocytes and the protective mechanism is related with the decrease of mRNA expressions of COX-2,iNOS,MMP-1 and MMP-13 mRNA.

Bushenqiangjin capsule-contained serum;Interleukin-1β;Chondrocytes

R285.5

：A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.03.0327

2016－10－31

廣東省自然科學基金 （2014A030310128）；廣東省科技廳社會發展領域科技計劃項目 （2013B021800213）；廣東省科技廳社會發展領域科技計劃項目 （2013B021800214）；廣東省中醫優勢病種突破項目（粵中醫函 ［2015］19號）

姚楠 （1980－），男，博士學位，主管中藥師，主要從事中藥分子藥理學研究，E-mail：nanyao2000@126.com。