裸鼠鼻咽癌種植瘤微波消融實驗研究

張艷敏， 邴婧毓， 周廣騫， 郭文龍

（1內蒙古自治區呼倫貝爾市第二人民醫院 內科，內蒙古 呼倫貝爾162650；2佛山市中醫院，廣東 佛山 528000）

裸鼠鼻咽癌種植瘤微波消融實驗研究

張艷敏1*， 邴婧毓2， 周廣騫1， 郭文龍1

（1內蒙古自治區呼倫貝爾市第二人民醫院 內科，內蒙古 呼倫貝爾162650；2佛山市中醫院，廣東 佛山 528000）

目的 建立裸鼠皮下種植人源鼻咽癌CNE－2模型，模擬姑息性微波消融術，觀察消融術后殘瘤組織中反映細胞侵襲轉移能力的指標 （MMP－9）變化狀況。方法 建立裸鼠皮下種植人源鼻咽癌CNE－2動物模型，術后48小時處死動物，解剖腫瘤組織，進行HE染色病理檢查以及MMP－9與HSP90免疫組化檢測，通過與對照組比較，觀察消融術對鼻咽癌CNE－2腫瘤殘瘤組織MMP－9與HSP90蛋白表達的影響。結果 消融術后48小時，與未消融腫瘤組織比較，殘瘤組織MMP－9表達降低，而HSP90表達升高，差異均有統計學意義 （P<0.05）。結論 裸鼠種植瘤消融術后48小時的殘癌組織MMP－9表達降低，提示殘瘤組織侵襲能力可能一過性減弱；HSP90表達升高，可能與瘤細胞受熱刺激應激保護有關。

鼻咽癌；微波消融；殘瘤；增殖；侵襲

鼻咽癌 （nasopharyngeal carcinoma，NPC）是中國南方地區常見惡性腫瘤之一，約50%以上患者確診時已發生遠處淋巴結轉移，其致瘤性和高度轉移性是目前鼻咽癌治療最難攻克的難關。晚期鼻咽癌患者主要出現肝轉移和骨轉移［1］，可采用微波凝固熱消融進行治療。微波凝固熱消融是近年發展起來的一種治療惡性腫瘤的新技術，具有凝固范圍可靠、療效確切、無嚴重并發癥等特點，日益應用于腫瘤治療，但鼻咽癌肝臟轉移瘤消融術后的殘瘤組織細胞生長特性是否發生變化以及如何變化仍無統一定論。本研究通過建立裸鼠皮下種植人源鼻咽癌CNE－2模型，模擬姑息性微波消融術，對消融術后殘瘤組織進行免疫組化檢測，觀察殘瘤組織中反映細胞侵襲轉移能力的指標的變化狀況，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗設備與材料

1.1.1 實驗設備 微波消融儀器 （南京慶海微波電子研究所），功率范圍為 0～100 W；恒溫水浴箱 （上海之信儀器有限公司）；細胞培養箱：美國Thermo二氧化碳細胞培養箱；水平離心機 （湖南湘儀離心機儀器有限公司）。

1.1.2 實驗材料 ①雌性BALB／C裸鼠6只，4周齡，體重約15～20 g，購自廣東省動物實驗中心；②細胞株：取對數生長期的人鼻咽癌細胞株CNE－2；③主要試劑：抗HSP90小鼠單克隆抗體：Abcam，Inc；抗MMP－9抗體：Santa Cruz Biotechnology，Inc；胎牛血清：杭州四季清生物工程材料有限公司；胰蛋白酶（0.25%Trypsin－EDTA）：Gibco Inc；PBS：美國Hyclone公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 將6只接種人鼻咽癌CNE-2細胞的荷人鼻咽癌裸鼠隨機分成兩組：對照組 （3只）、實驗組 （3只）。

1.2.2 實驗步驟 ①細胞復蘇：液氮罐取出細胞凍存管并置于37℃水浴鍋中，均勻搖動，細胞解凍；離心后棄上清液，并加入培養液重懸細胞，將培養瓶置于CO2培養箱中培養。②細胞培養：將鼻咽癌CNE-2細胞置于RPMI-1640培養液中，并放置在5%CO2、37℃培養箱中。③荷CNE-2鼻咽癌細胞裸鼠模型建立：待細胞生長至對數生長期時，對裸鼠左側腹股溝-左側側腰部皮膚進行消毒，距接種點約1～1.5 cm進針，皮下注射0.15 mL細胞懸液 （細胞細胞數1.0×107／mL）。④微波消融：荷瘤裸鼠生長約3周后，腫瘤長徑約0.6～0.8 cm，消融功率選用40 W，時間20 s；消融術后，荷瘤裸鼠返回動物房飼養。⑤腫瘤標本病理檢測：荷瘤裸鼠消融術后48小時，處理動物（包括對照組），外科手術取出腫瘤，石蠟包埋，切片，HE染色，MMP-9和HSP90免疫組織化學檢測。⑥免疫組化結果判定：設陽性對照及PBS代替一抗作為陰性對照。若細胞核 （或細胞漿）出現棕褐色物質，則為陽性細胞 （MMP-9蛋白表達主要位于細胞核，HSP90蛋白表達主要位于細胞質中）。每個腫瘤標本選取1張白片進行免疫組化檢測，每張切片在高倍光學顯微鏡 （200×）下隨機選擇 5個視野，進行陽性細胞計數。MMP-9和HSP90陽性標準：陽性染色為在細胞膜或／和胞漿有棕黃色顆粒沉著。評分標準：根據陽性細胞數與細胞膜 （或細胞漿）的染色程度所占百分比進行評分：著色深 （2分），著色淡 （1分），基本不著色 （0分）；著色細胞占所計數細胞數百分比：＞50% （3分），26%～50% （2分），5%～25% （1分），＜5% （0分）。最終分數 =每張切片著色程度分值 ×著色細胞百分比分值。最終分數：4分及以上為強陽性 （＋＋），2～3分為陽性 （＋），0～1分為陰性 （-）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件分析實驗數據，計數資料采用兩獨立樣本秩和檢驗，P＜0.05為具有統計學差異。

2 實驗結果

2.1 殘癌組織病理觀察

實驗組荷瘤動物在進行腫瘤姑息微波消融術后48小時處死該裸鼠，取出殘余腫瘤，固定包埋。殘余腫瘤消融區肉眼呈圓錐形，消融邊界清晰，消融炭化區呈褐色。

光鏡下 （HE染色）可見 （見圖1）：①消融區中央鼻咽癌細胞形態消失，間質細胞胞漿紅染，胞核固縮，呈現完全性凝固性壞死。②殘瘤邊緣區可見鼻咽癌細胞形態正常，無細胞核固縮表現。

2.2 鼻咽癌殘瘤與對照組腫瘤組織免疫組化結果

與未消融的對照組腫瘤組織 （見圖2B）比較，消融術后48小時殘瘤組織 （見圖2A）MMP-9蛋白表達降低而HSP90蛋白表達升高： 陰性 （-）視野數為 18；強陽性 （＋＋）視野數為26。兩獨立樣本秩和檢驗顯示，鼻咽癌種植瘤消融后MMP-9與HSP90蛋白表達與對照組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

圖1 鼻咽癌消融術后2天殘瘤HE染色 （×200）

圖2 兩種不同處理組織的MMP－9表達 （×400）

表1 鼻咽癌微波消融后殘瘤組織MMP－9與HSP90蛋白表達與對照組比較 （n）

3 討論

鼻咽癌為我國南方地區常見的惡性腫瘤之一，大多數患者在就診時已發生頸部淋巴結轉移或其它臟器多發轉移，其致瘤性和高度轉移性是目前鼻咽癌的治療中最難攻克的難關。晚期鼻咽癌患者主要出現肝轉移和骨轉移，其中肝轉移發生率為10%～36%［2-4］，而發生肝轉移后患者的中位生存期僅3.2個月，亦有研究［3］表明有一定比例的鼻咽癌患者的死亡原因是肝轉移。

微波消融治療的實質為熱療，該療法的原理是通過提升腫瘤微環境溫度來殺傷腫瘤細胞。熱刺激正常組織細胞或腫瘤細胞時，會誘導腫瘤細胞發生熱休克應答，使腫瘤細胞分泌大量熱休克蛋白。熱休克蛋白對腫瘤細胞的作用主要包括兩個方面：①腫瘤細胞發生初期維持其穩定性；②抵抗外界不良刺激。在對腫瘤組織進行微波熱消融治療過程中，熱休克反應有利于保護腫瘤細胞，熱休克蛋白幾乎可以從現有的所有治療腫瘤的過程中發揮保護腫瘤細胞的作用，可以說，熱休克蛋白是腫瘤細胞自身保護的武器。

本實驗結果顯示，鼻咽癌瘤塊姑息性消融術后，殘瘤組織的HSP90蛋白表達增高 （P＜0.05），提示可能與殘余鼻咽癌細胞受熱刺激后保護自身、減少外界刺激的傷害有關。此外，HSP90抑制劑可增強腫瘤對放射治療的敏感性，從而誘導腫瘤細胞凋亡。邵汛帆等［5］的研究對微波腔內熱療聯合放射治療鼻咽癌原發灶進行觀察，結果顯示，聯合治療可提高原發灶局部控制率。Li等［6］對18例鼻咽癌肝轉移且行微波治療的患者進行了回顧性分析，18例患者共24個肝轉移灶，轉移瘤大小約1.9～4.2 cm，共給予27次消融術，治療后22.4個月的隨訪結果顯示，4例患者出現新轉移灶，其中肝內2例，并再次成功行微波治療；3名患者于隨訪期內死亡。該研究結果提示微波消融術為治療鼻咽癌肝內轉移瘤的有效方法。

本實驗對實體殘瘤組織進行HSP90蛋白免疫組化檢測，顯示殘瘤組織HSP90蛋白表達較對照組顯著增高 （P＜0.05），與細胞實驗熱浴后48小時結果不同，考慮為細胞實驗處于倍增期，雖然熱刺激后HSP90蛋白表達很快升高，但經過48小時后，細胞已增殖，其基本生物特性已恢復常態，故其HSP90蛋白表達基本恢復正常。而組織中，細胞增殖慢，組織受強刺激后，HSP90仍在組織細胞中，故殘瘤組織HSP90消融后48小時仍表現為HSP90蛋白高表達。

MMP-9是基質金屬蛋白酶家族成員之一，可降解細胞外基質多種成分，如基底膜主要成分Ⅳ型膠原［7-8］。腫瘤細胞表達MMP-9與侵襲轉移能力有關。一項關于乳腺癌的研究［9］顯示，乳腺癌組織中MMP-9的表達量與乳腺癌分級呈密切的正相關關系。MMP與腫瘤侵襲轉移關系密切，腫瘤在侵襲過程中，原發惡性腫瘤細胞進入與突破血管均需MMP降解血管基底膜，MMP為腫瘤細胞發生血源性遠處轉移的關鍵因素。此外，MMP-9在腫瘤組織周圍血管亦高表達，提示血管生成的關鍵步驟與腫瘤侵襲的過程類似。相關實驗研究［10-12］顯示，MMP不單單對細胞外基質與蛋白進行降解，同時參與細胞增殖、凋亡、分化及血管生成。MMP通過降解ECM刺激機體釋放bFGF，從而刺激血管生成。

本研究中，消融術后48小時殘瘤組織與對照組比較，免疫組織化學顯示消融后48小時殘瘤MMP-9表達降低 （P＜ 0.05），而HSP90表達升高 （P＜0.05）。因此認為殘瘤組織侵襲能力一過性降低，但是否存在1周或2周后殘瘤組織侵襲能力增強，還有待于進一步研究。本研究存在一定的局限性：細胞蛋白質表達檢測時間點可再增加，有利于動態觀察鼻咽癌CNE-2微波消融術后不同時間點殘癌組織中MMP-9與HSP90蛋白表達情況，有助于更深入觀察殘瘤的生物學特性。

本實驗結果顯示，消融術后48小時殘癌組織MMP-9表達降低，提示殘瘤組織侵襲能力一過性減弱的可能；HSP90表達升高，可能與瘤細胞受熱刺激應激保護有關。

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（責任編輯：常海慶）

Experimental Study on Microwave Ablation of Transplanted Tumor of Nasopharyngeal Carcinoma in Nude Mice

ZHANG Yanmin1*,BING Jingyu2,ZHOU Guangqian1,GUO Wenlong1
(1Department of Internal Medicine,Hulun Buir Second People's Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region,Hulun Buir 162650, China;2Foshan Hospital of TCM,Foshan 528000,China;*

ZHANG Yanmin,E-mail:zhym93@163.com)

Objective To establish animal model of CNE-2 in nude mice,to simulate palliative microwave ablation and to observe the changes of invasion marker(MMP-9)in residual tumor after microwave ablation.Methods Animal model of CNE-2 in nude mice was established.The nude mice were sacrificed at 48 hours after microwave ablation for tumor tissue anatomy,HE staining pathological examination,MMP-9 and HSP90 immunohisto-chemistry detection.The effects of ablation on MMP-9 and HSP90 protein expressions in residual tumor of CNE-2 were observed and compared with those of control group.Results Compared with control group,the expression of MMP-9 in residual tumor at 48 hours after ablation decreased,but the expression of HSP90 in residual tumor increased,with statistical differences(P＜0.05).Conclusions 48 hours after ablation,MMP-9 protein expression in residual tumor decreases,which suggests that the invasive ability of remnant tumor decrease transiently;HSP90 protein expression in residual tumor increases,which may be related to tumor cells'stress protection induced by heat stimulation.

Nasopharyngeal carcinoma;Microwave ablation;Residual tumor;Proliferation;Invasion

R739.63

：A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.03.0332

2016－11－21

：2017-01-23

張艷敏 （1962－），女，山東龍口人，本科學歷，主治醫師，研究方向：腫瘤內科治療。

*通訊作者：張艷敏，E-mail：zhym93@163.com。