氣相色譜內標法測定松節中α-蒎烯的含量

1.貴州醫科大學民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心/藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州　貴陽　550004； 2.貴州醫科大學藥學院，貴州　貴陽　550025；3.貴州醫科大學組織工程與干細胞實驗中心，貴州　貴陽　550004； 4.貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州　貴陽　550004

松節為松科植物云南松(PinusyunnanensisFranch.)、馬尾松(PinusmassonianaLamb.)的干燥瘤狀節，具有祛風燥濕，舒筋活絡，活血止痛之功效，可用于關節疼痛，筋骨攣急，腳痹痿軟，跌撲瘀諸病[1]。松節入藥始載于《名醫別錄》[2]，廣泛分布于四川、云南、貴州和廣西等地。收載于《貴州省中藥、民族藥材質量標準》(2003版)，但該標準未明確規定其質量控制方法，對不同來源的松節藥材中α-蒎烯含量進行含量測定，為松節藥材的質量標準提升提供依據，有一定理論意義和實際應用價值。目前對于松樹藥用價值的研究，主要是針對松花粉、松針、松香和松節油，而對松節的研究較少[3]。α-蒎烯為松節中重要的組成成分之一，也是松節油中主要成分，可用于肌肉痛及關節痛，許多進口藥用油均以α-蒎烯含量作為質量指標[4]。中藥材一般成分復雜，質量難以把控，然而單一成分含量標準具有較好的可控性和易操作性，為現在最常用的方法之一。研究以α-蒎烯作為指標成分，使用環己酮作為內標，運用氣相色譜法對其含量進行研究，為松節的質量控制提供依據。

1　儀器與材料

1.1儀器GC 2010plus型氣相色譜儀(自動進樣器，氫火焰離子化檢測器，日本島津儀器有限公司)；安捷倫7890A型氣相色譜儀；KQ-300DE超聲機(昆山市超聲儀器有限公司)；XR 2O5SM-DR十萬分之一電子天平(瑞士Precisa)。

1.2材料α-蒎烯對照品(批號：110897-200001，中檢院)；11批松節樣品(詳見表6)由貴州醫科大學藥學院生藥學與藥用植物學教研室龍慶德副教授鑒定，正己酮(內標)、無水乙醇均為色譜純。

2　方法與結果

2.1氣相色譜條件色譜柱：ZB-5毛細管柱(5%苯基95%二甲基聚硅氧烷，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；流速為1.0 mL/min；程序升溫：初始溫度60 ℃，保持2 min，以20 ℃/min速率升溫至160℃，再以120 ℃/min速率升溫至260 ℃，保持2 min；進樣口溫度200 ℃；FID檢測器溫度300 ℃；進樣量1 μL，10∶1分流比進樣。上述色譜條件的圖見圖1。

2.2內標溶液的制備精密量取環己酮100.33 mg至5 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，再精密吸取2.5 mL至500 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，作為內標溶液。

2.3對照品溶液的制備精密稱取α-蒎烯對照品26.22 mg至100 mL容量瓶中，用內標液稀釋至刻度，再精密吸取2 mL至5 mL容量瓶中，用內標液定容至刻度，作為對照品溶液。

2.4供試品溶液的制備取本品粉末(過三號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入內標液25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率100 W，頻率50 kHz，水溫30 ℃)20 min，放冷，再稱定重量，用乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

2.5線性關系的考察精密稱取α-蒎烯對照品26.81 mg至50 mL容量瓶中，用內標溶液稀釋至刻度，再分別吸取4、2、1、0.5、0.25、0.125 mL至5 mL量瓶中，用內標溶液定容，分別吸取上述溶液1 μL進樣，記錄峰面積。以α-蒎烯的峰面積與內標峰面積的比為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程：y=15.759x-0.0946，R=0.9996，表明α-蒎烯在0.125～4 mg濃度范圍內線性關系良好。

2.6重復性實驗分別精密稱取同一松節藥材粉末1.5 g (3份)，2 g (3份)，2.5 g (3份)，共計9份，按供試品溶液制備方法及色譜條件，分別測定松節的含量，結果RSD為1.19%，表明儀器的重復性良好。

2.7中間精度實驗變更操作人員，變更日期，在同一實驗室，按上述方法分別制備3份供試品溶液，使用島津GC 2010氣相色譜儀連續進樣6次，進樣量1 μL。第一次測定α-蒎烯的含量平均值為1.176 mg/mL，RSD為0.73%；第二次測定結果的平均值為1.176 mg/mL，RSD為0.86%，說明方法的中間精密度良好。

2.8耐用性實驗

2.8.1穩定性實驗取同一供試品，按“2.4”方法制備供試品溶液，取供試品溶液一份，吸取1 μL根據GC分析時間，在0/1/2/4/6/8小時分別進樣5次，記錄α-蒎烯峰面積，RSD為0.54%，表明供試品中α-蒎烯再8小時內穩定。結果見表1。

表1　穩定性實驗結果

2.8.2不同色譜柱比較按照擬定的色譜條件分別以HP-5 (30 m × 0.32 mm × 0.25 μm)和ZB-5 (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)兩種石英毛細管柱對同一批號3份供試品溶液進行含量測定，結果兩種不同品牌色譜柱測定結果基本一致。結果見表2。

表2　不同色譜柱測試結果

2.8.3不同進樣口壓力比較將進樣口壓力變為75.4、80.9和87.1 kPa，其余色譜條件不變，對同一批號3份供試品進行測定，結果表明改變進樣口壓力，含量測定結果基本一致。結果見表3。

表3　不同進樣口壓力測試結果

2.8.4不同儀器比較分別以安捷倫GC 7890A、島津GC-2010Plus，其余條件不變，對樣品進行測定，結果表明，兩種品牌兩種型號的氣相色譜儀測定結果基本一致。結果見表4。

表4　不同儀器比較

2.9回收率試驗取同一批含量為1.174 mg/g的松節藥材粉末9份，每份2 g，分別按樣品中α-蒎烯本底值加入50% (3份)、100% (3份)、150% (3份)的對照品，按“2.4”方法制備供試品溶液，按“2.3”方法制備對照品溶液，按照擬定的色譜條件測定。α-蒎烯平均回收率為103.81%，RSD為0.71%。結果見表5。

表5　加樣回收率實驗結果

2.10樣品測定取松節樣品11批，每份樣品精密稱取2份，每份2 g，按“2.4”方法制備供試品溶液，按“2.3”方法制備方法對照品溶液，按照擬定的色譜條件進行測定，計算α-蒎烯含量。結果見表6。

表6　不同來源松節α-蒎烯含量測定

續表

表6　不同來源松節α-蒎烯含量測定

3　討論

松節作為常見的中藥材，廣泛應用于中藥處方中，在《名醫別錄》和《本草匯言》等書中均有提及，但其質量標準尚未明確。2015年版《中華人民共和國藥典》采用α-蒎烯作為油松節指標性成分[5]，鑒于油松節和松節藥效作用相似，研究使用α-蒎烯作對不同產地的松節進行含量測定，對松節的質量控制，具有一定的實用意義。

內標法具有測定結果較為準確的優點，是氣相色譜中常用的定量方法。本研究采用氣相色譜內標法測定松節中α-蒎烯的含量。內標物的選擇方面，在確定α-蒎烯的保留時間后，考察了不同化合物(環己醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、環己酮等)與指標成分的分離，最終選擇可以與α-蒎烯保留時間相近且分離較好的環己酮作為內標物。本實驗確定的色譜條件在不同儀器(日本島津GC-2010plus，安捷倫7890A型)，不同色譜柱(HP-5、ZB-5)以及不同進樣口壓力下均顯示出較好的耐用性。

綜上，本研究使用經濟低毒的無水乙醇超聲提取松節簡單方便，采用氣相色譜內標法測定松節中α-蒎烯含量，具有快速、簡便、準確的優點。不同批次的松節中α-蒎烯相差較大，可能是松樹的生長環境、年限以及儲藏條件等原因造成的。

[1]貴州省藥品監督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質量標準[M].貴州:貴州科技出版社,2003:247.

[2]陳曦.HPLC測定松節、松針和松香中銀松素和甲基醚的含量[J].天津藥學，2014，26(5)：21-23.

[3]張林林，薛健，劉東靜，等.油松節藥材中α-蒎烯的測定方法研究[J].中草藥，2009，11：1817-1818.

[4]朱沛韶，陳浩桉，吳翔.松節油中α-蒎烯的測定[J].中藥材，1999，22(7)：362-363.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M] .北京:中國醫藥科技出版社, 2015:227.