四君子合小柴胡湯對移植性原發性肝癌抑瘤作用的實驗研究

羅昌國+張晶+李陽

[摘要] 目的 觀察四君子合小柴胡湯對移植性原發性肝癌小鼠腫瘤生長的影響。方法 100只肝郁脾虛型移植性原發性肝癌小鼠隨機分為模型組、5-FU 組、四君子湯組（簡稱四君組）、小柴胡湯組（簡稱柴胡組）、四君子合小柴胡湯組（簡稱君柴組），每組20只。模型組、四君組、柴胡組、君柴組小鼠分別給予蒸餾水、四君子湯、小柴胡湯、四君子合小柴胡湯灌胃，每天1次，連續給藥10d；5-FU 組隔天1次給予 5-FU注射液腹腔注射，給藥5次。觀察各組小鼠的體質量、瘤重、腫瘤細胞凋亡、細胞周期。結果 小鼠體質量比較，各組顯著高于模型組（P<0.05），君柴組高于5-Fu組（P<0.05）。比較小鼠去瘤體質量，各組顯著高于模型組（P<0.05），君柴組高于5-Fu組（P<0.05）。比較腫瘤瘤重和抑瘤指數，5-Fu組、君柴組顯著低于模型組、四君組和柴胡組，差異有統計學意義（P<0.05）。比較抑瘤率，5-FU 組、君柴組顯著高于四君組和柴胡組（P<0.05）。細胞凋亡比較，君柴組高于四君組、柴胡組（P<0.05），顯著高于模型組（P<0.01）。比較腫瘤細胞凋亡，其余4組均顯著高于模型組（P<0.05），君柴組顯著高于四君組和柴胡組（P<0.05）；細胞周期所占百分比比較，5-Fu組、君柴組G0-G1期細胞顯著高于模型組（P<0.05）；S期細胞百分比，5-Fu組、君柴組G0-G1期細胞顯著低于模型組、四君組和柴胡組（P<0.05），G2-M 期各組比較差異無統計學意義（P>0.05）。結論 四君子合小柴胡湯對肝郁脾虛型移植性原發性肝癌小鼠有抑瘤作用，比四君子湯、小柴胡湯單獨應用好，其作用機制主要是誘導肝癌細胞凋亡。

[關鍵詞] 四君子湯；小柴胡湯；原發性肝癌；動物實驗

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）06-19-04

[Abstract] Objective To observe the effect of Sijunzi decoction combined with Minor Bupleurum decoction on tumor growth of mice with transplanted primary liver cancer. Methods 100 mice of hepatic stagnation and spleen deficiency type with transplanted primary liver cancer were randomly divided into the model group， 5-FU group， Sijunzi decoction group （abbreviated as Sijun group）， Minor Bupleurum decoction group （abbreviated as bupleurum group） and the Sijunzi combined with Minor Bupleurum decoction group （abbreviated as Jun bupleurum group）， with 20 in each. Mice in the model group， Sijun group， bupleurum group and Jun bupleurum group were respectively given gastric perfusion of distilled water， Sijunzi decoction， Minor Bupleurum decoction and Sijunzi decoction combined with Minor Bupleurum decoction for once every day with successive administration for 10 days. 5-FU group was given 5-FU injection by intraperitoneal injection for 5 times for once every two days. Body mass， tumor weight， tumor cell apoptosis and cell cycle of mice in every group were observed. Results Body mass of mice of every group was significantly higher than that of the model group （P<0.05）. Body mass of mice of the Jun bupleurum group was higher than that of the 5-Fu group （P<0.05）. By comparing body mass without tumor weight， that of every group was significantly higher than that of the model group （P<0.05）. Jun bupleurum group was higher than that of the 5-Fu group （P<0.05）. Tumor weight and anti-tumor indexes of the 5-Fu group and Jun bupleurum group were significantly lower than those of the model group， Sijun group and bupleurum group. Differences had statistical significance （P<0.05）. Anti-tumor rates of the 5-Fu group and Jun bupleurum group were significantly lower than those of Sijun group and bupleurum group （P<0.05）. Cell apoptosis of Jun bupleurum group was higher than that of the Sijun group and bupleurum group （P<0.05） and significantly higher than that of the model group （P<0.01）. Tumor cell apoptosis of other four groups was significantly higher than that of the model group （P<0.05）. Tumor cell apoptosis of Jun bupleurum group was significantly higher than that of Sijun group and bupleurum group （P<0.05）. By comparing percentage of cell cycle， G0-G1 stage cells of 5-FU group and Jun bupleurum group were significantly higher than that of the model group （P<0.05）. Percentage of S stage cell， G0-G1 stage cell of 5-FU group and Jun bupleurum group was significantly lower than that of the model group， Sijun group and bupleurum group （P<0.05）. Comparing G2-M stage cells， there were no statistical difference （P>0.05）. Conclusion Sijunzi decoction combined with Minor Bupleurum decoction has anti-tumor effect on mice of hepatic stagnation and spleen deficiency type with transplanted primary liver cancer and it has a better effect than single application of Sijunzi decoction and Minor Bupleurum decoction. The action mechanism is mainly to induce apoptosis of hepatoma cells.

[Key words] Sijunzi decoction； Minor Bupleurum decoction； Primary liver cancer； Animal experiment

原發性肝癌（HCC）是我國常見惡性腫瘤，每年新發肝癌和死于肝癌的患者居全球首位。中醫藥是我國治療肝癌的重要方法，通過多年臨床實踐和研究，中醫肝癌診治已有一些初步共識。肝郁脾虛被認為是原發性肝癌中醫證型之一[1]，疏肝健脾法被認為可以用于治療肝癌，大量臨床和實驗研究表明四君子湯和小柴胡湯對原發性肝癌有一定的抑瘤和抗轉移作用，體外試驗表明，四君子湯可通過激活外周血單核細胞發揮抗腫瘤作用[2-3]，小柴胡湯能夠抑制癌細胞生長，并誘導腫瘤細胞凋亡[4-5]，四君子湯可健脾，小柴胡湯能疏肝，兩方均對原發性肝癌有一定治療作用，但根據中醫理論，兩方聯合使用才能完整體現“疏肝健脾”的治療內涵，但兩方聯合使用的研究尚不多見。本研究采用肝癌動物模型，研究四君子湯聯合小柴胡湯（下稱四君子合小柴胡湯）對肝癌的抑瘤作用，并對比兩方單獨使用，觀察其療效是否更好。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 昆明種小鼠100只，雌雄各半，體質量（20±2）g，由深圳市疾病預防控制中心提供，購自南京君科生物工程有限公司，SPF 級條件下飼養，動物合格證號：SCXK（蘇）2016-0056。

1.1.2 藥物 5-氟尿嘧啶注射液（5-FU，南通精華制藥有限公司，批號：FA161004）：生物安全柜中操作，以無菌生理鹽水稀釋至2mg/ mL后EP管分裝，冰箱冷藏保存。四君子合小柴胡湯：人參10g，白術15g，茯苓15g，甘草6g，柴胡25g，生半夏10g，黃芩10g，生姜10g，大棗10g。四君子湯：人參10g，白術15g，茯苓15g，甘草5g。小柴胡湯：人參10g，柴胡25g，生半夏10g，黃芩10g，生姜10g，大棗10g，甘草6g。中藥生藥由康美藥業提供，水煎后蒸餾提取至含生藥2mg/mL的水煎液，冰箱冷藏保存備用。

1.1.3 瘤株、試劑及儀器設備 肝癌H22腹水細胞，購于中國科學院深圳先進分院；RPMI-1640培養液購自北京索萊寶科技有限公司；小牛血清（FBS） 購自浙江天杭生物科技股份有限公司，流式細胞儀（FC 500 MCL/MPL，美國貝克曼庫爾特公司），酶標儀（美國BioTek公司），生物安全柜（蘇州凈化設備公司）。

1.2 方法

1.2.1 病證模型 肝癌肝郁脾虛模型：造模分2個步驟，第1步，進行肝郁脾虛型造模，采用束縛加飲食失節法；第2步，肝郁脾虛型造模后第6天進行肝癌造模，第10天完成病證模型造模。肝郁脾虛型造模方法：采用束縛加飲食失節法，每晚將小鼠裝入特制透氣塑料小管中，并固定四肢和尾部限制活動，使其不能前進、后退及轉身，束縛同時限制飲食，8h/d，共10d。肝癌模型造模方法：復蘇凍存的腹水型肝癌 H22 細胞株，體外培養傳代至對數生長期，離心，PBS 緩沖液沖洗后，生理鹽水4倍稀釋，充分混勻，于每只小鼠右前肢腋窩下皮下注射0.2mL。

1.2.2 分組及給藥 造模后24h，將100只小鼠隨機分為5組，每組20只，分別是模型組、小柴胡湯組（柴胡組），四君子湯組（四君組）、四君子合小柴胡湯組（君柴組）、5-Fu組。按組別分籠飼養，常規飲食。接種后第5天開始給藥，柴胡組、四君組、君柴組、模型組4組小鼠按常規劑量分別予小柴胡湯、四君子湯、四君子合小柴胡湯、蒸餾水灌胃，1 次/d，連續給藥10d；5-FU 組按照 0.1mg/10kg體重隔天1次給予 5-FU 腹腔注射，連續給藥10d。

1.2.3 觀測指標

1.2.3.1 荷瘤小鼠體質量和去瘤體質量 荷瘤小鼠體質量在每日給藥前測定。去瘤體質量（g） = 處死前小鼠體質量（g）-解剖獲得的腫瘤實際重量（g） 。

1.2.3.2 腫瘤瘤重、腫瘤指數及腫瘤生長抑制率（抑瘤率） 各組解剖所得腫瘤稱重，即得腫瘤瘤重。腫瘤指數=腫瘤重量（g）/小鼠去瘤體重（g）。抑瘤率（%）=[1-實驗組瘤重（g）/模型組瘤重（g）]×100%。

1.2.3.3 腫瘤細胞凋亡指數檢測 將新鮮腫瘤組織1.0g左右，按常規方法制備成細胞懸液并洗滌離心106個單細胞，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡百分比，觀察細胞周期。

1.3 統計學方法

所有數據應用SPSS13.0軟件進行統計學處理。所有資料以（）表示，多組間比較現采用方差分析進行顯著性檢驗，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠體質量及去瘤體質量比較

各組顯著高于模型組（P<0.05），君柴組高于5-Fu組（P<0.05）。比較小鼠去瘤體質量，各組顯著高于模型組 （P<0.05），君柴組高于5-Fu組（P<0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠腫瘤瘤重、腫瘤指數及抑瘤率比較

君柴組、5-Fu組腫瘤瘤重及腫瘤指數顯著低于其他三組，差異有統計學意義（P<0.05）。比較抑瘤率，5-FU 組、君柴組顯著高于四君組和柴胡組（P<0.05）。見表2。

2.3 各組小鼠腫瘤細胞凋亡指數比較

比較腫瘤細胞凋亡，其余4組均顯著高于模型組（P<0.05），君柴組顯著高于四君組和柴胡組（P<0.05）；細胞周期所占百分比比較，5-Fu組、君柴組G0-G1期細胞顯著高于模型組（P<0.05）；S期細胞百分比，5-Fu組、君柴組G0-G1期細胞顯著低于模型組、四君組和柴胡組（P<0.05）。見表3。

3 討論

3.1 肝癌病機

中醫學認為，原發性肝癌屬“肝積”“癥瘕積聚”“臌脹”“黃疸”等范疇，肝癌多因情志抑郁，臟腑失調，氣機郁滯，濕困中焦，久則脾虛食少，濕郁化熱，熏蒸肝膽，氣滯血瘀久而成肝積，其中以肝郁脾虛型多見[6-7]，中醫學認為，肝脾兩臟關系密切，脾必得肝木的條達活潑、升散疏泄之性，才能升降如常；肝氣亦需脾氣的滋養。肝為剛臟，必賴脾氣之柔潤濡養，方能不致剛強太甚而遂其條達之性。四君子湯出于《太平惠民和劑局方》，小柴胡湯出自《傷寒論》，均是中醫經典名方，四君子湯可以健脾益氣，小柴胡湯可以疏肝理氣。四君子湯治療氣虛脾弱證，小柴胡湯治療肝郁氣滯證，臨證常以兩者結合加味化裁。大量研究顯示中醫健脾理氣治療在延長肝癌患者生存期、提高患者生存質量方面發揮了重要作用[8-9]。

3.2 研究現狀

劉曉霓等[10-11]通過肝癌中醫臨床用藥薈萃分析發現單味藥用藥頻率第1～4位的是白術、茯苓、黨參、柴胡，常用經典方有四君子湯、小柴胡湯、一貫煎、香砂六君子湯等。羅春蕾等[12]通過實驗研究發現四君子湯能促進小鼠肝癌細胞凋亡，影響腫瘤細胞周期，發揮抑瘤作用。李然[13]認為少陽樞機不利是肝癌發病的重要前期因素，提出了小柴胡湯和解樞機在防治肝癌方面的重要地位。李世杰[14]發現肝癌根治術后患者用小柴胡片后，可以降低復發率。王濟國等[15]研究發現肝癌肺轉移應用小柴胡湯可增強化療療效。

綜上所述，本研究著眼于四君子湯聯合小柴胡湯對小鼠移植性肝癌的抑瘤作用，觀察兩方聯合使用是否較單獨使用有更好的療效，以求為中醫治療肝癌提供更好的方藥依據。本研究中，在腫瘤瘤重、腫瘤指數、抑瘤率方面，四君子合小柴胡湯組比兩個方藥單獨使用表現更好的抑瘤效果，在腫瘤細胞凋亡方面，可見到聯合使用組比兩個單獨使用組有更多的腫瘤細胞凋亡，差異均有統計學意義。表明四君子聯合小柴胡湯使用比該兩方單獨使用有更好的抑瘤效果，作用機制可能是誘導腫瘤細胞凋亡，值得進一步研究。

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（收稿日期：2017-01-29）