熱處理對菠菜和上海青類囊體膜及葉綠素穩定性的影響

樊昶昶，熊新星，鄒亞紅，于昊永，張 燕

(中國農業大學食品科學與營養工程學院/國家果蔬加工工程技術研究中心，北京 100083)

熱處理對菠菜和上海青類囊體膜及葉綠素穩定性的影響

樊昶昶，熊新星，鄒亞紅，于昊永，張 燕

(中國農業大學食品科學與營養工程學院/國家果蔬加工工程技術研究中心，北京 100083)

綠色蔬菜在加工和貯藏過程中發生的顏色劣變與類囊體膜上葉綠素蛋白復合體的穩定性有著密切的關系。本研究以上海青和菠菜為原料，研究了兩種綠色蔬菜在熱處理過程中類囊體膜溶液熱容、多肽組分、葉綠素含量、pH以及蛋白質熒光的變化。結果表明：熱處理會導致葉綠素蛋白復合體的降解，類囊體膜溶液pH下降，上海青類囊體膜熱穩定性、葉綠素含量的保持優于菠菜類囊體膜。試驗結果為我們明確綠色蔬菜顏色劣變的機理以及尋求更好的護綠手段提供了理論基礎。

類囊體膜；葉綠素蛋白復合體；熱穩定性；葉綠素

綠色是展示綠色蔬菜及其制品品質的重要指標，但綠色蔬菜加工和貯藏過程中通常會發生嚴重的顏色劣變，嚴重影響外觀和消費者的接受度，不利于影響著綠色蔬菜加工產業的發展。因此，探索合適的技術延緩加工綠色蔬菜的顏色劣變就顯得極為重要。但在此之前需要明確綠色蔬菜顏色劣變的機理。目前，綠色蔬菜顏色劣變主要歸咎于葉綠素的降解，并認為葉綠素的降解途徑主要有兩條：由外界環境如溫度和酸主導的降解途徑，這一過程大多存在于經過一定加工的綠色蔬菜中[1]；另一條是由葉綠素酶和脫鎂葉綠素螯合酶主導的代謝途徑，這個途徑通常發生在衰老的植物葉片中[2]。

針對目前加工綠色蔬菜中存在的顏色劣變問題，較為常用的護綠策略為：采用葉綠素銅鈉或葉綠素鋅鈉進行染色[3]、調節pH值護綠[4-5]、熱燙[4，6-7]、UV-B輻照等殺滅、鈍化酶活，控制酶主導的葉綠素降解[8]，加入抗氧化劑，抑制酶活，應用ZnCl2、CuCl2金屬離子[4，9]可有效提高熱加工綠色蔬菜的顏色。由此可見，對于加工綠色蔬菜顏色控制的策略和方法，仍然集中于對葉綠素降解的控制，但增效多不明顯。

多年來，附于類囊體膜上的葉綠素蛋白復合體是調控綠色劣變的根本，這一實質問題沒有被廣泛關注。經過加工的綠色蔬菜，類囊體膜不同程度受損，葉綠素蛋白復合體降解，從而釋放出游離的葉綠素，葉綠素進一步被降解，才導致加工綠色蔬菜最終的顏色劣變。為了尋找更加合適的調控綠色蔬菜顏色劣變的方法，提高加工綠色蔬菜制品品質，本文以葉綠素蛋白復合體是穩定綠色的根本這一觀點出發，研究熱處理對不同蔬菜的類囊體膜和葉綠素的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

購于農貿市場的新鮮上海青以及菠菜，洗凈瀝干后，參考盧然[10]、王蓉蓉[11]的方法，置于4 ℃冷庫中進行預冷處理，大約1h后取出預冷的葉片進行類囊體膜的提取，得到類囊體膜制備液，而后進行水浴加熱處理。控制水浴鍋升溫速率為10℃/10min，升溫范圍為20～90℃，在溫度上升至30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃時依次取出樣品并以溫度為標記編號。

1.2 試驗儀器與設備

2000 D型超純水器，北京長風儀器儀表公司；S-HH-W21-Cr600型恒溫水浴鍋，北京長安科學儀器廠；KQ-250DE型超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；差式掃描微量熱儀Nano DSC，美國TA公司；安捷倫1260c型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Varian Cary Eclipse型熒光分光光度計，美國安捷倫公司；YP11/TN-EPS 300型電泳儀，北京中西遠大科技有限公司；MODEL868型pH計，美國奧立龍公司；BS223S型電子天平，德國Sartorious公司；CR21GIIIHITACHI型高速冷凍離心機，日立集團；EY-300A型分析天平，日本松下電器公司；JYL-610型九陽打漿機，九陽股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 類囊體膜熱容測定 參照Cramer等[12]的方法，類囊體膜溶液放置在鋁坩堝中，升溫范圍為25～120℃，升溫速率為 1 ℃/min。使用差示掃描微量熱儀測定上海青及菠菜的類囊體膜溶液摩爾熱容的變化。

1.3.2 類囊體膜多肽組分測定 參照韋司棋[13]的方法，取出經熱處理的類囊體膜溶液，每個樣品取出20 μL類囊體膜溶液，加入等體積2×蛋白上樣緩沖液，渦旋混勻，于100℃的沸水中變性5 min，冷卻后在12 000 g條件下離心5 min，取上清液點樣，再加電極緩沖液，當指示劑到達板前2 cm完畢，取出膠放在水中10 min，然后放入到配置好的染色液中，染色0.5～1 h，用水洗2～3次，再加入脫色液脫色10 min，進行3次后，放到搖床上，待條帶清晰背景清晰時，可采用凝膠成像系統進行攝影。

1.3.3 葉綠素含量測定 用50 μL的加熱過后的類囊體膜溶液，再加入0.95 mL的甲醇，再用0.22 μm的針孔濾膜過濾，裝于液相小瓶之中。方法參照Teng & Chen[14]，色譜柱選用Cosmosil 5C18-AR-II(NACALAITESQUE，INC，5μm，4.6mm UEAR-II)，流動相：乙腈：甲醇：三氯甲烷：正己烷=75∶12.5∶7.5∶7.5(v/v/v/v)，柱溫為30℃，流速為1 mL/min，等度洗脫，檢測波長為430 nm，進樣量為20 μL。

1.3.4 類囊體膜溶液pH測定 使用pH計測定加熱過程中的上海青和菠菜的類囊體膜溶液的pH值，待穩定后記下讀數，每個點重復測定3次。

1.3.5 類囊體膜溶液的蛋白質熒光測定 類囊體膜溶液的蛋白熒光采用Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer 儀器進行測定。取40 g鮮重葉片制備出的類囊體膜溶液10 mL，進行加熱處理，處理之后，每個樣品取8 μL溶解于1 mL的A液中。以278 nm波長的光激發，檢測300～400 nm處的發射光譜。

2 結果與分析

2.1 類囊體膜熱容變化

差示掃描量熱儀可用于研究生物膜結構和功能、蛋白質和核酸構象變化。熱容的變化能夠反映樣品中蛋白質的熱穩定性，熱容變化越大說明蛋白質穩定性較差。相變點能夠反映蛋白質結構變化，從而推測物質變化的規律[15]。由圖1可以看出，上海青對應的相變溫度依次為51.38、60.55、63.75、70.96、84.61、104.66、109.85℃，均高于菠菜42.59、50.80、56.36、69.39、76.44、82.49、86.90℃，表明上海青的類囊體膜熱穩定性優于菠菜。而在30～90℃的溫度區間內，菠菜的熱容變化明顯高于上海青，熱容變化越大表明蛋白質的穩定性越差，容易在加工中受熱處理的影響而發生改變，能夠反映出上海青的類囊體膜的穩定性優于菠菜。

圖1 類囊體膜的熱容變化注：a菠菜類囊體膜體系；b上海青類囊體膜體系

2.2 熱處理過程中多肽組分變化

由圖2a、b可知，菠菜和上海青類囊體膜多肽組成及各組分比例存在較大差異，菠菜的類囊體膜多肽組分種類較上海青豐富。升溫至60 ℃時菠菜和上海青類囊體膜多肽組分沒有發生明顯的變化；70℃時光系統Ⅱ外周天線蛋白LHCⅡ蛋白逐漸降解；90 ℃時，代表光系統Ⅰ反應中心蛋白質亞基PsaA和PsaB的條帶模糊，說明此時光系統Ⅰ已經被破壞，結果與Hu等[16]相同。結果表明，溫度對類囊體膜中的多肽組分有顯著影響，70℃時光系統Ⅱ被破壞分解、90℃時光系統Ⅰ被破壞分解。多肽組分及功能的保持對于維持色素蛋白復合物中葉綠素的穩定性抑制其降解具有積極的影響，因此高溫處理對葉綠素蛋白復合體的破壞不利于葉綠素的保持。

2.3 熱處理過程中葉綠素含量的變化

如圖3所示，菠菜類囊體膜中葉綠素a含量隨著溫度升高明顯下降，葉綠素b也隨之降低，與葉綠素a相比，葉綠素b的降解很小。而上海類囊體膜中葉綠素a含量變化呈現出波動的趨勢，在60～70 ℃時降解最顯著，但是葉綠素b的含量整體上變化不大。這與之前的研究結果葉綠素a 較葉綠素b對熱處理有較低的耐受性[17]相同。

圖3b中上海青在80℃時葉綠素含量上升，而圖3a并沒有觀察到葉綠素a含量升高。可能是由于菠菜、上海青光系統Ⅱ捕光復合物組成和穩定性差異造成的。一方面，光系統Ⅱ捕光復合物在70℃左右時結構被破壞，釋放出大量游離葉綠素，導致葉綠素含量增加[18]；但隨著溫度的增加，葉綠素因受熱逐漸降解，表現為葉綠素含量下降。光系統Ⅱ捕光復合物的熱穩定性不同，游離葉綠素釋放過程存在差異，導致溶液中葉綠素含量變化趨勢不同。不同種類的綠色蔬菜可能由于類囊體膜結構不同、組分不同、或組分之間比例不同而在同等的外界條件處理之下展現出了不同的特性[19]。

圖2 熱處理對類囊體膜多肽組分的影響注：a菠菜類囊體膜體系；b上海青類囊體膜體系

圖3 熱處理對類囊體膜溶液中葉綠素含量的影響注：a菠菜類囊體膜；b上海青類囊體膜

圖4 熱處理對類囊體膜溶液pH影響

2.4 熱處理過程中pH的變化

圖4可以看出隨著溫度的升高，菠菜和上海青的類囊體膜溶液的pH下降，在同樣的熱處理條件下上海青類囊體膜溶液的pH 值下降的幅度較菠菜小。類囊體膜pH變化的機理是光合作用下，通過電子傳遞鏈的作用，質子醌會接受氫離子，同時也會影響氫離子向類囊體通道轉運，以此來使類囊體膜的基質側的pH值發生明顯的變化[20]。pH的下降說明熱處理會抑制質子醌的釋放和傳遞，加速氫離子的轉運。不僅如此，pH的維持能夠一定程度的保護類囊體膜中的熱耗散功能從而保護光合器官免受破壞[21]。如果植物的pH梯度不夠，不能保持一定的pH值，就不能耗散多余的熱量，影響光合器官即增加葉綠素的解離和降解[22-23]。

因此，上海青能夠維持較高的pH，在一定程度上保護了光合器官，減緩了葉綠素的解離與降解。然而菠菜體系由于pH的下降幅度更大，因此保護光和器官的效果相對較弱。

2.5 溫度對類囊體膜蛋白熒光的影響

蛋白質變性過程中，芳香族氨基酸分子的側鏈基團逐漸暴露于水溶液中，其所處的環境極性逐漸增加，因此蛋白質熒光發射峰的Amax最大吸收峰逐值漸增大，同時λmax最大吸收峰位置藍移的程度能夠反映出蛋白質構象變化的程度。藍移的程度越大則能夠說明，蛋白質構象變化的程度也越大。由附表可以看出，菠菜最大吸收峰位波動幅度較上海青大，但最大峰值均出現先上升再下降的趨勢，說明加熱處理改變了類囊體膜上的蛋白質的組成和結構[24]。菠菜在80 ℃、上海青在90 ℃時蛋白質的熒光強度下降，這說明熱處理對蛋白質的破壞程度逐漸增強，使得類囊體膜的多肽組分發生了降解，導致了蛋白質組分和含量減少，從而導致蛋白質熒光強度的減弱。色氨酸的熱分解是分三步，首先脫去氨基和羧基，其次脫去乙基，最終是剩余物的完全熱氧降解。因此我們也可以認為在80℃以上時進行的是第三步的完全降解，最終導致熒光強度的下降[25]。

附表 熱處理對類囊體膜溶液體系蛋白發射熒光光譜的影響(278nm)

注：λmax最大吸收峰位；Amax最大吸收峰值

3 結論

差式掃描微量熱儀的數據顯示上海青的類囊體膜熱穩定性較菠菜的更強，即不同種類蔬菜的類囊體膜在物理性質上存在差異，同時上海青和菠菜類囊體膜的多肽組分差異很大，這些多肽對溫度敏感，溫度越高多肽降解越顯著。加熱過程中上海青和菠菜的類囊體膜溶液的pH會逐漸下降，葉綠素蛋白復合體結構被破壞，使一部分蛋白質的氨基酸殘基暴露出來，繼續加熱，會導致這種破壞的程度更大，從而使得蛋白質的分解，與之對應，葉綠素含量隨溫度的上升而下降。綜上所述，在加工過程中可以通過保持類囊體膜上的葉綠素蛋白復合體的穩定性來調控加工綠色蔬菜顏色的劣變。◇

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(責任編輯 李婷婷)

Effects of Thermal Treatment on Stability of Thylakoid Membrane and Chlorophyll of Spinach andBrassicachinensis

FAN Chang-chang，XIONG Xin-xing，ZOU Ya-hong，YU Hao-yong，ZHANG Yan

(College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University/National Engineering & Technology Center for Fruit and Vegetable Processing，Beijing 100083，China)

The deterioration of color in green vegetables is closely related to the stability of chlorophyll-protein complexes located in thylakoid membrane during processing and storage.We tested heat capacity，polypeptides，chlorophyll content，pH and protein emission spectra of thylakoid membrane solution in spinach andBrassicachinensisunder thermal treatment，it showed that thermal treatment would lead to the degradation of chlorophyll-protein complexes and decrease of pH in thylakoid membrane solution.Otherwise，thylakoid membrane ofBrassicachinensisis more thermal stable and the remaining ratio of chlorophyll content is higher than spinach.All these provide a theoretical basis to clarify the mechanism of green vegetable color deterioration and to find a better way to protect green.

thylakiod membrane; chlorophyll-protein complexes; thermal stability; chlorophyll

高靜壓加工綠色蔬菜顏色品質變化的分子機制研究(項目編號：31271910)；加工綠色蔬菜中葉綠素蛋白復合體和葉綠素的降解與控制策略(項目編號：31571844)。

樊昶昶(1994— )，女，碩士研究生，研究方向：食品科學。

張燕(1977— )，女，博士，副教授，研究方向：果蔬加工技術理論與應用。