水產品中呋喃唑酮代謝物檢測結果不確定度的評定

馬瑞欣　王曉靜　周凡　王國輝

摘 要：采用液相色譜--串聯質譜法檢測水產品中呋喃唑酮代謝物的殘留量。對影響檢測結果的各分量不確定度進行了分析，最終得到檢測結果在置信水平約95%、包含因子k=2時的擴展不確定度。結果表明，測量重復性和標準工作曲線是影響樣品中AOZ殘留量結果的主要因素。

關鍵詞：呋喃唑酮代謝物（AOZ）；液相色譜——串聯質譜法；不確定度

不確定度是指由于測量誤差的存在，對被測量值不能肯定的程度。它是檢測結果質量的指標。不確定度越小，檢測結果與被測量的真值越接近，檢測結果質量越高；不確定度越大，檢測結果質量越低。JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》中測量不確定度的定義為：表征合理地賦予被測量之值的分散性，與檢測結果相聯系的參數[1]。《檢驗檢測機構資質認定評審準則》4.5.15條規定“檢驗檢測機構應根據需要建立和保持應用評定測量不確定度的程序”。

本文參考農業部783號公告-1-2006[2]檢測方法，對呋喃唑酮代謝物（AOZ）殘留量測定結果的不確定度來源進行了分析和評定，最終得到檢測結果在置信水平約95%、包含因子k=2時的擴展不確定度。

1 方法原理及步驟

1.1 稱量

稱取樣品2.0 g（精確到0.01 g）于離心管中。

1.2 水解和衍生化

加入100 μL內標溶液渦旋混勻50 s，再加入5 mL鹽酸溶液和0.15 mL 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋振蕩50 s，置于恒溫水浴振蕩器中37 ℃避光振蕩16 h。

1.3 提取凈化

取出離心管冷卻至室溫，加入3～5 mL 磷酸氫二鉀溶液，調節pH=7.0～7.5，加入4 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩50 s，離心，取上清液轉移至10 mL離心管中；再加入4 mL乙酸乙酯重復上述操作，合并上清液于40 ℃下氮氣吹干。準確加入1.0 mL水渦旋振蕩溶解殘渣，過0.22 μm濾膜，待測。

1.4 標準工作曲線制作

取10 ng/mL AOZ標準溶液0.025 mL、0050 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL 于8個離心試管中，操作步驟同1.2和1.3。

1.5 定量測定結果

以AOZ定量離子響應面積As與內標定量離子響應面積Ai之比對濃度做工作曲線，曲線強制過原點。樣品制備液中AOZ的濃度由儀器工作站按標準工作曲線給出。

1.6 樣品中AOZ殘留量按下式計算：

2 不確定度評定

2.1 影響檢測結果的過程描述

2.1.1 AOZ標準儲備溶液的配制 稱取 10.0 mg AOZ，用甲醇定容至50 mL，濃度為200 μg/mL。AOZ純度為 99.6±0.3%。所用儀器和器皿：十萬分之一電子天平（兩次稱量相減）、50 mL容量瓶。

2.1.2 AOZ中間液的制備 取儲備液50 μL用水稀釋至100 mL，濃度為100 ng/mL，取5 mL該溶液，用水稀釋至50 mL，濃度為10 ng/mL。所用儀器和器皿：100 μL移液槍、5 mL移液管、50 mL容量瓶、100 mL容量瓶。

稱取樣品2.00 g，加入100 μL內標溶液。 所用儀器：百分之一電子天平（兩次稱量相減）、100 μL移液槍。

氮吹濃縮至干后用水定容至1.0 mL。所用儀器：1.0 mL移液槍。

標準工作曲線取8個點衍生同上，最后用水定容至1.0 mL，每個濃度點只進樣一次，以AOZ定量離子響應面積As與內標定量離子面積Ai之比對濃度做工作曲線，曲線強制過原點。所用儀器：1.0 mL移液槍。

測定儀器：AB SCIEX QTRAP4500 液相色譜-串聯質譜聯用儀。

2.2 各分量標準不確定度的評定

2.2.1 檢測重復性標準不確定度u1

獨立檢測3份樣品，所得結果為：2.24 μg/kg，2.28 μg/kg，2.44 μg/kg，平均值為2.32 μg/kg。

單次檢測的實驗標準差計算公式為：

日常分析中，檢測兩份平行樣品，報告平均值。兩次檢測結果平均值的相對標準不確定度為：

u1rel=S（X）2X=0.1061.414×2.32=0.032 3

此分量（A類不確定度）綜合體現了檢測方法、測定儀器、體積與質量測量中各個方面的隨機效應。因此，在隨后評定其他分量時不需要再考慮隨機效應了。

2.2.2 ci的不確定度u2

2.2.2.1 標準工作曲線擬合引入的標準不確定度u2（1）

因強制過原點，標準曲線9個點，結果見表1：

標準工作曲線一次性方程為： y=0·121 63x，r=0.999 39

標準工作曲線擬合引入的不確定度計算公式[3]為：

u2（1）=S（cp）=S（f）b1p+1n+（f-f）2b2∑ni=1（Ci-C）2

式中：p—樣品平行測定的次數；n—擬合直線的點數；b—擬合直線的斜率，b=0.121 63；

cp—試樣測試值；c—繪制擬合直線輸入值Ci（n個）的平均值。

本實驗中：n=9 ， p=2，2個平行樣品中AOZ定量離子面積分別為y1=155 019，y2=147 926；內標定量離子面積分別為y內1=537 903，y內2=539 252。f1=155 019537 903=0.288 2，f2=147 926539 252=0.274 3，標準偏差s（f）=0.009 829。利用擬合直線得到2個平行樣品上機溶液的對應濃度為2.369 ng/mL和2.255 ng/mL，平均值2312 ng/mL，樣品上機溶液的濃度通過擬合標準工作曲線確定，由標準工作曲線擬合引入的不確定度為：

2.2.2.2 內標體積的標準不確定度u2（2）

查檢定證書得知：100 μL移液槍在100 μL檢定點的誤差為2.0 μL，區間半寬度為1.0 μL，服從三角分布，包含因子k=6，其標準不確定度為：1.0 μL/k=6=0.41 μL。實驗在20 ℃下進行，實驗室溫度介于±5 ℃之間，水的體積膨脹系數為 2.07×10-3 / ℃，服從均勻分布，區間半寬度為 5 ℃×2.07×10-3 ℃-1=1.04×10-2，包含因子k=3，由溫度變動引入的標準不確定度為1.04×10 合成標準不確定度為u2（2）=0.412+0.00 602=0.41（μL）

相對合成標準不確定度為：u2（2）rel=0.41100=0004 1

樣品制備液中AOZ濃度的相對不確定度是上述分量的合并，即：

u2rel=u22（1）rel+u22（2）rel =0.028 02+0.004 12=0.028 3

2.2.3 AOZ標準溶液濃度的標準不確定度u3

2.2.3.1 AOZ儲備溶液濃度的標準不確定度

a.AOZ質量的標準不確定度u3（1）

十萬分之一電子天平的最大允差為±0.01 mg，服從均勻分布，區間半寬度為0.01 mg，由此項引入的不確定度為0.01 mg/3=0.005 77 mg

天平分辨力為0.01 mg， 服從均勻分布，區間半寬度為0.005 mg，引入的標準不確定度為0005 mg/3=0.002 89 mg

合成標準不確定度u（m）=0.005 772+0.002 892=0.006 45（mg）；標準物質10.0 mg是通過兩次稱量相減得到，故u3（1）rel=2×0.006 4510.00=0.000 912

b.50 mL容量瓶體積的標準不確定度u3（2）

50 mL A級容量瓶在20 ℃的體積為50 mL±0.05 mL，假設為三角分布，區間半寬度0.05 mL，由此項引入的標準不確定度為0.05 mL/6=0.020 4 mL

容量瓶在20 ℃校準，實驗室溫度在（20±5） ℃之間，液體的膨脹體積明顯大于容量瓶的體積膨脹，因此只需考慮液體體積膨脹。甲醇的膨脹系數為0.001 20 ℃-1，由此項引入的標準不確定度為5×0.001 203=0.03 46（mL）

合成標準不確定度為：u3（2）=0.020 42+0.003 462=0.020 7（mL），相對合成標準不確定度為：u3（2）rel=0.020 7/50=0000 414

c.AOZ純度的標準不確定度u3（3）

AOZ純度 99.6±0.3%，區間半寬度為03%，服從正態分布，包含因子k=1.96，由此項引入的不確定度u3（2）rel=0.003/1.96=0.001 5，相對標準不確定度為：u3（2）rel=0.001 5/0.996=0.001 5

2.2.3.2 中間稀釋液引入的標準不確定度

a.移液槍引入的體積標準不確定度u3（4）

100 μL移液槍在50 μL檢定點的誤差為1.5 μL，區間半寬度為0.75 μL，假設為三角分布，包含因子k=6。因此，其標準不確定度為0.75 μL/6=0.306 μL。

甲醇的膨脹系數為0.001 20 ℃-1，由此項引入的標準不確定度為：5×0.001 203=0.003 46（μL）

合成標準不確定度為u3（4）=0.3062+0.003 462=0.306（μL），相對合成標準不確定度為u3（4）rel=0.306/50=0.006 12

b.50 mL容量瓶引入的體積標準不確定度u3（5）

50 mL A級容量瓶在20 ℃的體積為50 mL±0.05 mL，假設為三角分布，區間半寬度0.05 mL，由此項引入的標準不確定度為0.02 mL/6=0.020 4 mL

由2.2.2.2知因水的體積受溫度的變動引入的標準不確定度為 0.006 0 mL。

合成標準不確定度為：u3（5）=0.02 042+0.006 002=0.021 3（mL），相對合成標準不確定度為：u3（5）=0.021 3/50=0000 426

c.吸量管引入的體積標準不確定度u3（6）

據JJG196-2006中規定，5 mLA級分度吸量管的允差為±0.025 mL，符合三角分布，區間半寬度為0.025 mL，由此項引入的標準不確定度0.025 mL/6=0.010 2 mL

由2.2.2.2知因水的體積受溫度的變動引入的標準不確定度為 0.006 0 mL。

合成標準不確定度u3（6）=0.010 22+0.006 002=0.011 8（mL），相對合成標準不確定度為：u3（6）rel=0.011 8/5.00=0002 36

d.100 mL容量瓶引入的體積標準不確定度u3（7）

100 mL A級容量瓶的允差為±0.10 mL，假設為三角分布，區間半寬度為0.10 mL，由此項引入的標準不確定度為0.10 mL/6=0.040 8 mL

由2.2.2.2知因水的體積受溫度的變動引入的標準不確定度為0.006 0 mL。合成標準不確定度u3（7）=0.040 82+0.006 02=0.041 2（mL），相對合成不確定度為：u3（7）rel=0.041 因此標準溶液在配制和稀釋過程中引入的相對合成標準不確定度為 ：

2.2.4 試樣質量m稱量的標準不確定度u4

天平檢定合格，天平說明書中標明允差為±0.01 g，服從均勻分布，區間半寬度為0.01 g，包含因子k=3，其標準不確定度為0.01 g/3=005 8 g

天平說明書中標明其分辨力為0.01 g，服從均勻分布，區間半寬度為0.005 g， 包含因子k=3，其標準不確定度為0.00 5 g/3=0.002 9 g

m稱量的合成標準不確定度u4=0.005 82+0.002 92=0.006 48 g

稱取樣品2.00 g，通過2次稱量相減獲得，m的相對合成標準不確定度為：

2.2.5 試樣體積V的標準不確定度u5

檢定證書上1 mL移液槍的誤差為0.001 mL，區間半寬度為0.000 5 mL，服從三角分布，包含因子k=6，因此，其標準不確定度為0.000 5 mL/6=0.000 204 mL

由2.2.2.2知因水的體積受溫度的變動引入的標準不確定度為0.006 0 mL。

試樣體積V的合成標準不確定度為：u5=0.000 2042+0.006 02=0.006 01（mL）

定容體積為1.000 mL，試樣體積V的相對合成標準不確定度為u3rel=0.006 011.000=0.006 00

2.2.6 回收率引入的標準不確定度u6

取9份空白樣品2.00 g ，分別加入4.00 ng標準溶液，加標量為2.00 μg/kg，按上述方法測定，測定結果見表2。

回收率的平均值R=19∑9i=1Ri=100，標準偏差SR=∑9i=1（R-R）n-1=3.23，回收率的相對不確定度u6rel=SRRn=3.23100×9 =0.010 7

采用t檢驗法對回收率進行顯著性檢驗，t=100-Ru（R）=100-1003.23/9=0，查表t0.95（8）=231，t

2.3 計算AOZ檢測結果的不確定度

2.3.1 合成相對標準不確定度

2.3.2 擴展不確定度 合成標準不確定度u（X）=1.16 μg/kg×0.045 4=0.052 7 μg/kg。95%概率下取包含因子k=2，則擴展不確定度為U=2×0.052 7 μg/kg=0.11 μg/kg。

2.3.3 檢測結果表示 樣品中AOZ殘留量的結果表示為（1.16±0.11） μg/kg，k=2。

3 結論

通過對各分量不確定度的評估可以看出：測量重復性不確定度和工作曲線引入的不確定度是影響樣品中AOZ殘留量檢測結果不確定度的主要因素。提高檢測結果的準確性可以通過優化穩定儀器工作狀態和準確配制標準系列來實現。本評定報告可對提高檢測結果準確度起到指導作用。

參考文獻：

[1]

國家質量監督檢驗檢疫總局.JJF1059.1-2012測量不確定度評定與表示[S].中國標準出版社，2013

[2] 中華人民共和國農業部.農業部783號公告-1-2006水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法[S].中國農業出版社出版，2006

[3] 周尊英，劉心同，實驗室質量管理統計技術[M].北京：中國標準出版社，2014：256.

（收稿日期：2016-11-21）