河八王分蘗基因NpD53克隆及其生物信息學分析

劉昔輝　張榮華　桂意云　張小秋　韋金菊　周會　區惠平　劉新龍

摘要：[目的]克隆河八王[Narengaporphyrocoma（Hance）Bor]分蘗基因NpD53，并分析其序列特征，為甘蔗野生種分蘗的分子機理研究提供理論參考。[方法]以河八王為試驗材料，提取其葉片總RNA，反轉錄獲得cDNA，通過RACE（cDNA末端快增）技術擴增NpD53基因，并采用生物信息學方法對其核苷酸序列及編碼蛋白的氨基酸序列進行分析。[結果]NpD53基因（GenBank登錄號MF593461）的中間序列長度760 bp、5端序列長度1497 bp、3端序列長度1233 bp，拼接后其cDNA序列全長為2597 bp，包含1個2037 bp的開放閱讀框（ORF），編碼678個氨基酸，蛋白分子量75.02 kD，等電點6.59，親水性平均數-0.506，表明其為親水性蛋白，位于細胞核內（可信度94.1%）。NpD53基因編碼蛋白（NpD53）存在P-looR NTPase和ClpB D2-small超家族核心序列，含有4個非特異性位點，與其他物種的D53蛋白均具有相同的保守結構域ClpB D2-small；其二級結構僅有4種卷曲類型，以無規則卷曲最多，占42.77%，其次是α-螺旋，占35.55%，延伸鏈和β-轉角分別占15.34%和6.34%。NpD53蛋白的氨基酸序列同源性比對及系統進化樹分析結果顯示，河八王與禾本科物種（高粱和山羊草）的親緣關系較近，與海棗、油棕、芭蕉等物種的親緣關系較遠。[結論]河八王分蘗基因NpD53編碼蛋白與其他物種的D53蛋白具有相同的保守結構域，且具有2個I類clD ATP酶的非特異性位點，推測NpD53為一種分子伴侶，與河八王自身的耐熱性相關。

關鍵詞：河八王；NpD53基因；克隆；序列分析；RACE

0引言

[研究意義]河八王[Narenga porphyrocoma （Hance）Bor]是一個甘蔗野生種，具有分蘗力強、耐貧瘠、耐旱等優良性狀（李楊瑞，2010）。甘蔗產量受單位面積有效莖數影響，而有效莖數由甘蔗的有效分蘗決定（李楊瑞，2010）。可見，分蘗是農作物莖數和穗數的重要性狀因子，對作物產量有重要影響（呂愛麗等，2016），而DWARF53（D53）基因編碼的D53蛋白與獨腳金內酯信號分子D14蛋白和D3蛋白互作形成D53-D14-SCFm蛋白復合體，D53蛋白作為獨腳金內酯信號途徑的抑制子，參與植物分蘗（分枝）等生長發育過程（Zhou et al.，2013）。因此，研究河八王分蘗基因D53及其分子調控機理，利用轉基因或雜交等技術進行甘蔗遺傳改良對提高甘蔗產量具有重要意義。[前人研究進展]獨腳金內酯是一種新型植物激素，屬萜類內酯，可抑制植物分枝生長、促進側根形成和誘導根毛伸長，從而調節植物的生長發育（Gomez-Roldan et al.，2008；吳轉娣等，2017），D14蛋白、F-box蛋白和D53蛋白等參與其信號轉導（陳虞超等，2015）。已有研究發現，水稻的3種DWARF蛋白（D27、D17和D10）將反式B-胡蘿卜素轉變成獨腳金內酯的前體己內酯（Alder et al.，2012），其他2種DWARF蛋白（D14和D3）在獨腳金內酯的感知和轉導中起重要作用（Ishikaw et al.，2005；Ariteet al.，2009）。其中D14蛋白屬于α/β-水解酶折疊家族，是獨腳金內酯的受體（Alder et a1.，2012），D3蛋白是一個富集亮氨酸重復序列的F-box蛋白，參與獨腳金內酯信號的接收（Zhao et al.，2013）。D53蛋白是連接獨腳金內酯信號接收和應答的重要抑制因子，當D53被降解，獨腳金內酯抑制植物分蘗（分枝）；當D53未被降解，則獨腳金內酯受到抑制，促使植物多分蘗（分枝）（Jiang et al.，2013）。D53基因是水稻的顯性基因之一。Wei等（2006）構建了水稻顯性矮稈突變體dwarf（d53），通過圖譜定位發現D53基因定位于11號染色體的斷臂上。Jiang等（2013）克隆獲得水稻的D53基因全長。[本研究切入點]目前，未見有關甘蔗野生種河八王分蘗基因的研究報道。[擬解決的關鍵問題]利用RACE（cDNA末端快增）技術克隆河八王D53基因（NpD53）全長，并進行生物信息學分析，為甘蔗野生種分蘗的分子調控機理研究提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為河八王，保育于廣西農業科學院甘蔗研究所。RNAprepPure植物總RNA提取試劑盒、DNase I Recombinant和SMARTer RACE 5'/3Kit購白天根生化科技（北京）有限公司。其余試劑均為國產分析純。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2總RNA提取及cDNA合成

剪取約0.1 g河八王幼嫩葉片，參照RNAprepPure植物總RNA提取試劑盒說明提取其總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，并參照SMARTerRACE 5/3Kit說明反轉錄合成cDNA。

1.3 NpD53基因克隆

1.3.1中間序列擴增 參考水稻分蘗基因D53（GeneBank登錄號KF709434.1）設計其中問序列的擴增引物（表1），反應體系（25.0uL）配置和擴增程序設置均參照2xES Taq MasterMix產品說明進行。PCR產物經膠回收純化后連接至pMD19-T克隆載體上，轉化DH5a感受態細胞，經菌液PCR驗證后，把含目的片段的陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.3.2兩端序列擴增 以NpD53基因的中間序列為基礎，設計NpD53基因5與3端RACE特異性引物（表1），采用RACE技術克隆NpD53基因的5與3末端序列。PCR產物經膠回收純化后連接至pMD19-T克隆載體上，轉化DH5a感受態細胞，經菌液PCR驗證后，把含目的片段的陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。對測序正確的5與3端序列進行拼接，得到NpD53基因cDNA全長序列。

1.4生物信息學分析

利用ORF Finder找出NpD53基因的開放閱讀框（ORF）編碼區。將獲得的NpD53基因cDNA提交至NCBI數據庫中進行比對，利用BLASTI具對其編碼蛋白（NpD53）進行氨基酸序列比對；基于NpD53蛋白的氨基酸序列與相似性較高的序列，利用MEGA6.0鄰接法構建系統進化樹，分析河八王與其他物種之間的親緣關系。

利用ExPASy ProteomicsServer在線軟件ProtParam預測NpD53蛋白的理化性質；利用ProtScale預測NOD53蛋白的親/疏水性；利用NCBI BLAST-E具預測NpD53蛋白的結構域；利用SOPMA軟件預測NOD53蛋白的二級結構；利用TMHMM Server v.2.0預測NpD53蛋白的跨膜結構；利用在線軟件SWISSMODEL構建NpD53蛋白的三維結構模型；利用Wolf-Sport在線軟件預測NpD53蛋白的亞細胞定位。

2結果與分析

2.1 NpD53基因克隆結果

由圖1可知，總RNA的28S和18S條帶明亮、清晰、完整，無其他雜質污染，說明提取的河八王幼嫩葉片總RNA質量較好，可用于后續試驗。

PCR擴增NpD53基因，其測序結果顯示，NpD53基因的中間序列長度760 bp，5端序列長度1497 bp，3端序列長度1233 bp，經ContigExpress軟件拼接后，其cDNA序列全長為2597 bp。

2.2 NpD53基因同源性比對及系統進化樹分析

將克隆獲得的NpD53基因cDNA序列提交至NCBI數據庫中進行核苷酸序列比對，結果顯示，該序列與高粱（Sorghum bicolor）（XIVl 002441614.2）、玉米（Zea mars L_）（KUl31574.1）和水稻（Orvza sativa）（KF709434.1）的D53基因核苷酸序列的同源性分別為95%、86%和77%，說明本研究克隆獲得的基因為河八王分蘗基因D53。利用ORF Finder找到NpD53基因的ORF編碼區（238-2364 bp），長度為2037 bp，編碼678個氨基酸，其中5非編碼區長度為237 bp，3非編碼區長度為233 bp（圖2）。

NpD53基因編碼蛋白（NOD53）與高粱（XP002441659.1）、山羊草（Aegilops tauschii）（XP 02016-8048.1）、小麥（Triticum aestivum）（ARB18226.1）和海棗（Phoenix dactylifera）（XP 008805019.1）D53蛋白的氨基酸序列同源性分別為91%、63%、59%和39%。利用MEGA 6.0進行氨基酸多序列比對，結果（圖3）顯示，NpD53與禾本科物種具有較高的同源性，其中與高粱的2個D53蛋白同源性最高，分別為91%和85%，而與海棗、油棕（Elaeis guineensis）、芭蕉（Musa acuminata subsp.malaccensis）等物種的同源性僅30%-40%，說明河八王與海棗、油棕、芭蕉等物種的親緣關系較遠，而與高粱的親緣關系較近。

2.3 NOD53蛋白的理化性質及親/疏水性預測結果

NpD53蛋白的理化性質及親/疏水性預測結果顯示，該蛋白分子式為C3226H5162N96401034532，分子量為75.02 kD，由678個氨基酸組成，其中包含負電荷氨基酸殘基86個和正電荷氨基酸殘基82個，絲氨酸含量最高，達13.0%；理論等電點（pI）為6.59，為酸性蛋白質；親水性平均數為-0.506，有較多區段位于0分以下，以親水性為主（圖4），表明其為親水性蛋白；不穩定系數為54.83，半衰期約為30 h，說明其為不穩定蛋白。

2.4 NOD53蛋白的功能結構域預測結果

利用NCBI BLAST-E具預測NOD53蛋白的結構域，結果（圖5）顯示，該蛋白存在P-loop NTPase和ClpB D2-small超家族核心序列，含有4個非特異性位點：ClpA、AAA 2、ⅥClpVl和ClDC。與圖3中的其他物種均具有相同的保守結構域ClpB D2-small。

2.5 NOD53蛋白的二級結構和三維結構分析

NpD53蛋白的二級結構預測結果（表2）顯示，該蛋白的二級結構僅有4種卷曲類型，其中無規則卷曲最多，占42.77%，其次是α-螺旋，占35.55%，延伸鏈和β-轉角分別占15.34%和6.34%。NpD53蛋白跨膜結構預測結果顯示，該蛋白無跨膜結構域。NpD53蛋白三維結構如圖6所示，同源模型為MecA-ClpC復合物（3j3u.1），但同源性較低，僅19.3%。NpD53蛋白的亞細胞定位預測結果顯示，該蛋白位于細胞核內，可信度94.1%。

3討論

獨腳金內酯屬類胡蘿卜素植物激素，Jiang等（2013）、Zhou等（2013）研究發現，在水稻中D53蛋白為獨腳金內酯信號轉導途徑的抑制因子，Liu等（2017）發現D53基因在小麥分蘗和穗數上起一定的調控作用。本研究首次從河八王中克隆得到NpD53基因，可為后續河八王分蘗機制研究打下理論基礎。

應用RACE技術可對mRNA末端進行快速擴增，具有快速、穩定和成功率高等優點，是有效獲取cDNA全長的有效手段之一（唐克軒等，2002）。本研究采用RACE技術克隆獲得河八王NpD53基因，其具有完整的ORF，其編碼蛋白NpD53的氨基酸序列與其他物種的D53蛋白具有相同的保守結構域clpB D2-small，與禾本科物種的同源性較高，其中與高梁的2個D53蛋白同源性最高，分別為91%和85%，而與海棗、油棕、芭蕉等物種的相似性僅30%-40%，說明不同物種問的D53蛋白可能有不同的結構和功能。ClpB是HSP100/Clp蛋白家族的一員，與細胞的耐熱性緊密相關，可溶解熱脅迫下的蛋白聚集體，從而減少熱激對細胞產生的損害，其序列具有高度保守特性（Katiyar-Agarwal et al.，2003）。其中胞質型HSPl01/ClpB蛋白是植物抗高溫必需的因子，推測HSPl01/ClpB轉基因水稻有較高的耐熱性（Katiyar-Agarwal et al.，2003；楊金瑩等，2006）。由此推測河八王中的ClpB也與植株的自身耐熱性有關。

已有研究證實，D53蛋白與I類Clp ATP酶類有相似的結構（Zhou et al.，2013），Clp ATP酶是細菌中高度保守的調節亞基，是一種分子伴侶，其自身無水解活性，其中I類Clp ATP酶類帶有2個不同的ATP結合區域（Frees et al.，2007）。本研究河八王NpD53蛋白序列中的非特異性位點ClpA和ClpC屬于I類，由此推測NpD53蛋白為一種分子伴侶，與河八王的自身耐熱性相關。

4結論

從河八王中克隆獲得的分蘗基因NpD53，其編碼蛋白NpD53與其他物種的D53蛋白具有相同的保守結構域，并具有2個I類Clp ATP酶的非特異性位點，由此推測NpD53蛋白為一種分子伴侶，與河八王自身的耐熱性相關。