茄子小孢子培養技術研究

范適　劉富中　陳鈺輝　宋燕　劉志敏　張野　連勇

摘要：[目的]開展茄子小孢子培養技術研究，為茄子單倍體育種在生產實踐上應用提供技術支持。[方法]以6個不同基因型茄子栽培品種為試材進行小孢子培養，探究基因型、花藥預處理、花藥壁組織及供體植株生長環境對茄子小孢子培養的影響。[結果]6個茄子栽培品種均能誘導出愈傷組織，但誘導頻率差異明顯，其中，37號和128號品種的小孢子愈傷組織誘導頻率極顯著高于其他品種（P<0.01，下同）；6個茄子品種中僅37號品種能形成再生植株，其中5株為單倍體植株，8株為雙單倍體植株。茄子小孢子培養必需進行高溫（36℃）熱激處理，最佳處理時間6 d；低溫（4℃）預處理不能啟動茄子小孢子脫分化形成愈傷組織，但能極大促進愈傷組織形成；花藥預處理以低溫（4℃）處理6 d+高溫（36℃）處理6 d的效果最佳，愈傷組織的誘導頻率達60.0個/花藥；花藥壁組織與小孢子共培養能促進愈傷組織形成，最佳處理時間8-12 d。供體植株在露地環境條件下小孢子愈傷組織誘導頻率極顯著高于溫室環境條件。[結論]對露地環境條件下種植的37號和128號茄子的花藥進行低溫（4℃）處理6 d+高溫（36℃）處理6 d，可獲得最佳的小孢子愈傷組織誘導效果。

關鍵詞：茄子；小孢子培養；基因型；花藥預處理；花藥壁組織；供體植株生長環境

0引言

[研究意義]茄子（Solanum melongena L.）是重要的茄科蔬菜作物，但生產中易受青枯病和黃萎病等病蟲危害，導致產量和品質降低。選育抗性品種是提高茄子產量和質量的有效方法（范適，2003），通過花藥培養及小孢子培養快速獲得雙單倍體目標材料，能加速茄子育種進程（范適等，2014）。小孢子培養具有能排除花藥壁組織干擾、誘導效率高等優點，在純化親本、突變體篩選及遺傳研究等方面得到廣泛應用。小孢子培養在煙草屬（Kyo and Harada，1985）及蕓苔屬（顧祥昆等，2013；張振超等，2013）的一些品種上已取得較理想效果，但有關其他作物小孢子的培養卻很難實現。因此，開展茄子小孢子培養技術研究，對促進茄子單倍體育種在生產實踐上應用具有重要意義。[前人研究進展]北京市農業科學院蔬菜研究所單倍體組（1978）、劉獨臣等（2008）通過茄子花藥培養已成功獲得單倍體植株。顧淑榮（1979）的研究結果證實，茄子的小孢子培養始于1979年，且獲得了愈傷組織。Miyoshi（1996）采用游離小孢子培養方法成功獲得了茄子再生植株。佟曦然等（2007）對茄子游離花粉培養發育過程進行較詳細的形態細胞學觀察，結果發現小孢子進行均等分裂和營養細胞分裂均能形成胚狀體或愈傷組織。宋彥平等（2007）研究表明，單核靠邊期小孢子是誘導愈傷組織發生的最佳時期，對花藥進行低溫和高溫結合處理有利于小孢子存活，能促進小孢子脫分化，但愈傷組織誘導頻率很低。李華等（2008）研究發現，對花藥進行高溫熱激處理會導致小孢子體積膨大，活力提高。[本研究切入點]目前，國內外雖已開展茄子小孢子培養技術研究，但小孢子愈傷組織的誘導頻率不高，難以從愈傷組織再分化獲得完整植株。[擬解決的關鍵問題]分析影響基因型、花藥預處理、花藥壁組織及供體植株生長環境等對茄子小孢子愈傷組織誘導的影響，旨在完善茄子小孢子培養技術體系，為茄子單倍體育種在生產實踐上應用提供技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試栽培茄子品種29號、30號、35號、36號、37號和128號均由中國農業科學院蔬菜花卉研究所茄子課題組提供。2014年3月育苗，4月底定植于中國農業科學院蔬菜花卉研究所蔬菜基地露地大田。

1.2小孢子發育時期細胞學觀察

參照李保慶（1995）的方法使用醋酸洋紅染色劑常規制片法進行小孢子發育時期細胞學觀察。用改良的卡諾固定液（95%7，醇：冰醋酸：氯仿=6：3：1）固定花蕾24 h，然后置于70%酒精中保存。觀察時，將花藥置于載玻片上，加少量醋酸洋紅染色劑，從中部切開花藥，使花粉散出，加蓋玻片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3花藥預處理方法

在前期試驗基礎上，選取37號和128號為試材，挑選盛花期處于單核中晚期的花蕾進行表面滅菌后剝出花藥，接種于花藥預處理培養基。低溫（4℃）和高溫（36℃）預處理均設0、2、4、6和8 d各5個時間；變溫預處理設低溫（4℃）處理2、4、6和8 d后再高溫（36℃）處理2、4、6和8 d。

花藥預處理培養基為MS+0.2 mg/L 2，4-D+0.5mg/L ZT+0.6%瓊脂+2.0%蔗糖；培養條件為黑暗，白天溫度為（274±1）℃、夜晚溫度為（224±1）℃。

1.4小孢子培養方法

挑選黃綠色、膨大的花藥，從中部切開，接種于誘導培養基中；每個培養皿（直徑6 cm）加誘導培養基5 mL、接種8個中部切開的花藥，石蠟膜封口，7 d后去掉藥壁殘渣。置于黑暗、溫度為27℃環境中培養10 d后轉入光照培養，光照時間為14 h/d，光強為2000 1X，培養5 d后，每培養皿加5 mL稀釋培養基，直至愈傷組織形成。

誘導培養基為KM+0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/LZT+1.0 mg/L NAA+7.5%葡萄糖，稀釋培養基為KM+0.1 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA+7.5%葡萄糖。

1.5花藥壁組織與小孢子共培養

選取37號和128號為試材，設0、4、8和12 d等4個共培養處理時間，對比不同共培養時間下愈傷組織的形成情況，探討花藥壁組織與小孢子共培養對茄子小孢子培養的影響。

1.6供體植株生長環境

選取37號和128號為試材，分溫室和露地2個生長環境進行常規栽培管理。溫室：2014年1月播種，2月下旬定植；露地：2014年3月播種，4月定植。對比不同生長環境下供體植株誘導愈傷組織的狀況，探討供體植株生長環境對茄子小孢子培養的影響。

1.7植株再生及再生植株的倍性鑒定

將愈傷顆粒轉移至含2.0%蔗糖、2.0 mg/L ZT、0.1 mg/L IAA和7.0 g/L瓊脂的MS再生培養基上，獲得不定芽，將不定芽移至含2.0%蔗糖、0.1 mg/L IAA和7.0 g/L瓊脂的MS生根培養基上，待獲得完整根系后進行馴化、移栽。再生植株用PAS全自動流式細胞儀進行染色體倍性鑒定。

1.8統計分析

各處理愈傷組織誘導頻率以“個/花藥”表示，采用SPSS 20.0進行統計分析，使用單因素方差分析進行組間差異顯著性比較。

2結果與分析

2.1茄子小孢子培養過程的形態學觀察

2.1.1小孢子發育時期的細胞學觀察 為確定茄子花蕾長度與小孢子發育時期的對應關系，對不同長度花蕾進行醋酸洋紅染色并進行細胞學觀察，結果見圖1。將不同長度花蕾分為9.2-9.9、10.0-11.1和11.2 mm以上三類（圖1一A），分別對應茄子小孢子的四分體時期、單核中晚期和成熟期。

四分體時期（圖1-B）小孢子母細胞經減數分裂成4個連在一起的細胞，呈四裂狀、四面體狀和四分狀3種形式。單核中晚期（圖1-C）小孢子的外部形態呈圓形，細胞核在細胞的中央或靠近邊緣處。成熟期（圖1-D）細胞體積變大，外部形態呈近圓形至橢圓形，極面觀呈三裂圓形，有3條萌發孔，細胞表面可見顆粒狀外壁紋飾。茄子小孢子培養最適宜的時期為單核中晚期，此時茄子花蕾長度為10.0-11.1 mm。

2.1.2愈傷組織形成過程的細胞學觀察 用倒置顯微鏡觀察小孢子培養過程中小孢子各發育時期的形態。花藥經變溫預處理后，小孢子出現明顯膨大，直徑可增大3倍（圖2-A）；3 d后觀察到小孢子的第一次分裂，多數為均等分裂（圖2-B）；7 d后可觀察到多細胞團（圖2-C）；20 d后有愈傷組織出現（圖2-D），愈傷組織呈黃綠色、圓球形，直徑約1.0 iYlln。

2.2茄子基因型對愈傷組織形成的影響

由表1可知，6個茄子品種均能形成愈傷組織。其中，37號品種的愈傷組織誘導頻率最高，達61.1個/花藥，極顯著高于其他品種（P<0.01，下同），且最早出現愈傷組織，第10 d即有愈傷組織形成；其次為128號品種，愈傷組織誘導頻率為46.9個/花藥，極顯著高于除37號品種外的其他品種；愈傷組織誘導頻率最低的為35號品種，僅7.1個/花藥，極顯著低于除36號品種外的其他品種，且最晚出現愈傷組織，第26 d才有愈傷組織形成。說明不同基因型的茄子小孢子愈傷組織誘導頻率差異明顯，以37號和128號品種小孢子愈傷組織發生能力較強。

2.3花藥預處理對愈傷組織形成的影響

2.3.1低溫（4℃）預處理對愈傷組織形成的影響對小孢子愈傷組織發生能力強的37號和128號品種進行低溫（4℃）預處理，結果發現各處理組（2、4、6和8 d）的花藥體積均未膨大，顏色未發生變化。將其中的小孢子接種到液體誘導培養基上后，通過倒置顯微鏡鏡檢，發現僅1%-2%小孢子膨大，絕大多數小孢子未啟動。培養40 d后，各處理均未形成愈傷組織。

2.3.2高溫（36℃）預處理對愈傷組織形成的影響從圖3可看出，高溫（36℃）預處理使愈傷組織誘導頻率極顯著提高，以預處理6 d處理組的愈傷組織誘導頻率最高，37號和128號品種的愈傷組織誘導頻率分別為28.5和18.4個/花藥，極顯著高于同品種的其他處理。說明高溫（36℃）預處理6 d茄子小孢子愈傷組織的發生能力最強。

觀察發現，在小孢子培養過程中經高溫（36℃）預處理各處理組的花藥體積均出現膨大，至6 d時，花藥體積增至最大，直徑可達預處理前的2-3倍；花藥顏色由淡綠色轉為黃綠色。在培養過程中通過顯微鏡檢查發現，高溫（36℃）預處理2 d后小孢子膨大率約10%，至6 d時，小孢子膨大率達50%。說明小孢子啟動導致花藥體積膨大。

2.3.3變溫預處理對愈傷組織形成的影響 由表2可知，小孢子接種到液體誘導培養基30 d后，各處理均有愈傷組織形成，愈傷組織的誘導頻率為11.2-60.0個/花藥，以低溫（4℃）處理6 d+高溫（36℃）處理6 d的誘導頻率最高，為60.0個/花藥，極顯著高于其他處理；其次是低溫（4℃）處理4 d+高溫（36℃）處理6 d，誘導頻率為44.4個/花藥，與低溫（4℃）處理8 d+高溫（36℃）處理6 d的差異不顯著（P>O.05，下同），顯著（P<0.05）或極顯著高于除低溫（4℃）處理6 d+高溫（36℃）處理6 d外的其他處理；低溫（4℃）處理2 d+高溫（36℃）處理2 d的誘導頻率最低，僅11.2個/花藥。因此，確定低溫（4℃）處理6 d+高溫（36℃）處理6 d是誘導茄子小孢子脫分化的最佳預處理組合。

2.4花藥壁組織與小孢子共培養對愈傷組織形成的影響

從圖4可看出，花藥壁組織與小孢子共培養能提高小孢子愈傷組織的誘導頻率，培養至第8 d時誘導頻率達最高，37號和128號品種的愈傷組織誘導頻率分別為52.4和40.0個/花藥，極顯著高于未進行花藥壁組織共培養的處理組。當共培養時間延長至12 d時，愈傷組織誘導頻率開始下降，但與共培養8 d處理組相比差異不顯著。說明花藥壁組織與小孢子共培養的最佳時間為8-12 d。

2.5供體植株生長環境對愈傷組織形成的影響

從圖5可看出，在露地環境條件下小孢子愈傷組織誘導頻率極顯著高于溫室環境條件，37號品種的愈傷組織誘導頻率為53.7個/花藥，比溫室環境條件處理組高71.6%；128號品種的愈傷組織誘導頻率為47.4個/花藥，比溫室環境條件處理組高65.7%。觀察發現，在溫室中生長的植株出現部分畸形果或無籽果實，說明供體植株在自然環境下生長更好。

2.6植株再生及再生植株的倍性鑒定

將愈傷組織轉移至再生培養基上進行培養，約30 d出現綠色芽點，約65 d分化成不定芽（圖6-A和圖6-B）及叢生芽（圖6-C和圖6-D）；將2-3 cm高的不定芽從基部切除移至生根培養基，20 d后可形成不定根，35 d后可形成完整的根系（圖6-E和圖6-F）；移植后，90%以上的小植株能成活（圖6-G）。

供試的6個茄子品種中，只有37號形成了13株再生植株，再生植株經流式細胞儀檢測，5株為單倍體植株，8株為雙單倍體植株。

3討論

供試的6個品種茄子均能誘導出愈傷組織，但誘導頻率差異明顯，其中，37號和128號品種的小孢子愈傷組織誘導頻率顯著高于其他品種；37號品種可形成再生植株，29號和128號品種能分化不定芽，但出現玻璃化現象，最終未能成苗。表明茄子基因型差異對其小孢子培養影響較大。在煙草（Kyo and Harada，1985）、芥菜（顧祥昆等，2013）、甘藍（張振超等，2013）等作物的研究中也出現相似的現象，說明基因型差異普遍存在于小孢子培養中。

小孢子培養一般需對花蕾或花藥進行預處理，如營養饑餓（蔗糖饑餓和氮饑餓）、低溫、高溫（熱激）、射線及激光處理等，其目的是通過預處理使小孢子偏離正常的配子體發育方向，啟動小孢子脫分化，進而形成胚狀體或形成愈傷組織通過器官化途徑成苗。這些預處理中，以高溫熱激處理效果最佳。高溫熱激預處理能促進細胞對稱分裂，改變小孢子發育方向（劉公社等，1995），是改變小孢子離體發育方向的主要途徑（李華等，2008）。經熱激等處理后的小孢子，在形態上改變了極性分布，細胞的生理狀態也發生改變，從而引起小孢子分裂方式和發育方向發生改變，使小孢子偏離正常的配子體發育途徑。Miyoshi（1996）、連勇等（2004）研究證實高溫熱激處理對茄子游離小孢子培養的必需性，高溫熱激處理會導致小孢子體積膨大，進而脫分化形成愈傷組織。本研究結果表明，對茄子花藥進行高溫（36℃）熱激處理的最佳處理時間為6 d。僅對茄子花藥進行低溫（4℃）預處理，小孢子體積未膨大，無愈傷組織形成，原因可能是低溫預處理不足以啟動茄子小孢子的脫分化。但花藥在低溫（4℃）預處理一定時間后再進行高溫（36℃）熱激處理，能極大提高小孢子愈傷組織的誘導頻率。

花藥壁組織在啟動小孢子脫分化及形成愈傷組織過程中發揮重要作用，甚至對不同物種離體花粉雄核發育也有較大促進作用（謝園園等，2014）。花藥壁組織特別是某些由絨氈層起源的重要物質，在花粉脫分化過程中具有吸收、儲存和轉化等代謝庫作用，同時有保護和調控作用，能促進小孢子脫分化的啟動并進一步形成愈傷組織（董艷榮和龔義勤，2001）。本研究結果也表明，花藥壁組織對啟動小孢子脫分化及形成愈傷組織過程有較大促進作用。

供體植株生長環境會影響花粉的發育狀況，進而影響植物小孢子培養（董艷榮和龔義勤，2001），生長在溫室中的植株其小孢子誘導率低于在自然環境中生長的植株（Ercan et al.，2006）。本研究結果也支持以上觀點，生長在溫室環境條件下的茄子其小孢子愈傷組織誘導頻率顯著低于露地環境條件處理組，觀察還發現出現較多畸形果及無籽或不成熟的茄子果實，證實溫室中生長茄子植株的花粉發育質量低于自然環境中生長茄子植株的花粉。其原因：一是溫室多使用玻璃、塑料薄膜等材料，對光有吸收和反射作用，特別是塵埃等雜質在溫室頂部積累較多時，導致透光率降低，光質下降；二是溫室晝夜溫差較小，未達到植物生長發育所需的溫周期；三是溫室空氣濕度大，作物易感病。

4結論

茄子的基因型差異對其小孢子培養影響較大，以37號和128號品種的小孢子愈傷組織誘導頻率較高；對露地環境條件下種植的37號和128號茄子品種花藥進行低溫（4℃）處理6 d+高溫（36℃）處理6 d，可獲得最佳的小孢子愈傷組織誘導效果。