橡膠樹1981’IRRDB野生種質苗期初生乳管分化的研究

金華斌　田維敏　史敏晶

摘 要 巴西橡膠樹的乳管是產生和貯存天然橡膠的組織。成齡樹樹干中的次生乳管因與割膠生產直接相關得到了全面的研究，而幼莖、葉初生生長形成的初生乳管因與天然橡膠生產沒有直接關系研究相對較少。利用光學顯微技術以及Image J統計分析軟件，對182份1981IRRDB野生種質苗期的初生乳管分化進行了研究。結果表明，不同種質葉片以及綠色莖皮中的初生乳管分化能力存在明顯差異；而同一種質小葉柄和莖皮中的初生乳管分化能力也并不完全一致。在這182份種質中，小葉柄初生乳管面積比例在0.08%～2.6%范圍內，但1%以上的種質數量僅占總數的30.8%；在莖皮中，初生乳管面積百分比在1.3%～13.3%范圍內，但7.5%以上的種質數量僅占總數的19.2%，可見，野生種質初生乳管分化能力普遍較低。來源于不同州的野生種質乳管分化能力存在明顯差異，由強到弱分別是朗多尼亞州（RO/）、阿克里州（AC/）、馬托格羅索州（MT/）以及其他非主選區域，其中，朗多尼亞州（RO/）可能更容易篩選到優良的種質。研究結果可為將來種質的引進以及灌木化栽培種質的選育提供依據。

關鍵詞 巴西橡膠樹；野生種質；初生乳管；乳管分化；灌木化

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract Laticifers in rubber tree are the sole site for natural rubber biosynthesis and storage. The secondary laticifer in the secondary phloem from trunk has been investigated comprehensively， but the primary laticifer in the tender stem and leaf was studied rarely for no relation with the nature rubber production. By using a light microscopy and Image J Software， the primary laticifer differentiation in the seedling among 182 1981IRRDB wild germplasms was analyzed. The results showed that there was obvious difference of primary laticifer differentiation amongst the germplasms and little consistency between the bark and leaf. The area ratio of primary laticifer in petiolule ranged from 0.08%-2.6%， in which more than 1% area ratio only 30.8% of the total germplasms. In the bark of stem， the area ratio of primary laticifer ranged from 1.3%-13.3%， but more than 7.5% area ratio only 19.2% of the total germplasms. Generally， the capacity of primary laticifer differentiation was low. To compare the germplasms derived from differential states found that， the capacity of primary differentiation had obvious discrepancy among states， from strong to weak was RO/， AC/， MT/， and otherssources，in which RO/ may be the best origin for screening excellent germplasms. The results would provide a basis for the introduction of germplasms and breeding of shrubby cultivation.

Key words Rubber tree； wild germplasm； primary laticifer； laticifer differentiation； shrubby

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.001

橡膠樹（Hevea brasiliensis）原產南美亞馬孫河流域的熱帶雨林，屬大戟科的多年生喬木，是世界上人工栽培最重要的產膠植物[1]，提供了世界所需大約98%以上的天然橡膠。橡膠樹中合成和貯藏天然橡膠的組織是乳管[2-3]，根據乳管的來源和細胞學等特征可以分為初生和次生乳管兩大類型[4]。成齡大樹的樹皮中含有大量次生乳管，在生產中，人們通過割膠即切割樹皮中的次生乳管收集排出的膠乳，提煉天然橡膠，次生乳管的多少與天然橡膠產量顯著正相關。因此，人們從細胞學、生物化學以及分子生物學等方面對次生乳管的發生、發育以及次生代謝等方面展開了深入的研究[5-9]。橡膠樹成熟的種子、葉、花、果實和根以及種子萌發到幼苗長出第一葉蓬的初生生長所形成的各部分器官中的乳管都屬于初生乳管[10-11]，初生乳管與天然橡膠生產沒有直接的關系，所以研究相對較少。

割膠是橡膠生產中的關鍵環節，也是當前收獲膠乳的唯一方式[12]，割膠對膠工的技術要求很高，但勞動強度大、生產環境條件差（現有技術水平下割膠生產通常是夜間作業），而且勞動報酬低，隨著我國勞動力數量進入拐點，膠工短缺和老齡化問題[13]已成為我國天然橡膠產業生存和發展的瓶頸。提高割膠勞動生產率或改變生產模式在現階段對于發展橡膠產業尤其急迫，機械化采收膠乳是未來的必然趨勢[14]。借鑒銀膠菊的種植模式，對橡膠樹進行灌木化栽培，機械化采收幼莖和葉等組織，提煉初生乳管中的膠乳，對于解決我國當前膠工日益短缺和老齡化是一條值得探索的生產模式，而選出適合灌木化栽培的種質是首要條件。

橡膠樹種質資源的分類、保存和遺傳分析是橡膠樹選育種的重要基礎。目前針對次生乳管的產量，我國對橡膠樹種質的鑒定和評價已經做了大量的工作[15-19]，但關于初生乳管的產膠能力評價較為缺乏。最早針對初生乳管干膠含量進行的葉脈膠法、小葉柄膠法[20-21]其目的是為了對大樹產膠潛力進行早期預測。本研究對182份1981IRRDB野生種質初生乳管分化能力進行初步的鑒定和評價，旨在探明不同野生種質苗期的產膠潛力是否存在差異，為選育適合灌木化栽培的種質提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 于中國熱帶農業科學院橡膠研究所儋州國家橡膠樹種質資源圃選取182份巴西橡膠樹不同來源地的1981IRRDB野生種質，其中來自巴西朗多尼亞州（RO/）和阿克里州（AC/）各49份，馬托格羅索州（MT/）50份，非主選區域34份（見表1），每份種質選取3株長勢良好的植株，每植株中選取一支處于穩定期的萌條，分別采集第一伸長單位的綠色莖皮以及該葉蓬基部健康葉片居中的小葉柄，制備石蠟切片。

1.1.2 主要試劑和儀器 制備石蠟切片所需的乙醇、正丁醇、冰醋酸、二甲苯為國產分析純，石蠟為生物組織切片專用，光學顯微鏡為德國Leica DMLB型。

1.2 方法

光學顯微切片的制備：材料分割后經80%（V/V）酒精固定24 h，乙醇梯度脫水，碘-溴冰醋酸試劑60 ℃處理36 h，乙醇脫水后經正丁醇透明，石蠟包埋，具體方法參見史自強等[22]并稍作修改。石蠟切片厚度10 μm，二甲苯脫蠟后固綠染色1 h，中性樹膠封片，光學顯微鏡Leica DMLB下觀察小葉柄和莖皮橫切面標本，并成像。對于小葉柄的材料，統計維管束初生木質部外側至皮層的區域中初生乳管所占的面積比例。對于莖皮材料，則統計次生韌皮部外側至初生韌皮纖維帶的區域中初生乳管所占的面積比例。

1.3 數據統計分析

利用Image J圖形處理軟件，每個樣品選取3個視野統計乳管面積比值，最后取3個材料的平均值。采用Excel 2003計算并制作圖表。

2 結果與分析

2.1 小葉柄初生乳管分化

小葉柄中具有多個維管束，圍繞中央部分的髓狀組織（基本組織）成圓圈排列。這些維管束由韌皮部、木質部和形成層組成，韌皮部向外側，木質部靠近中央的髓，而形成層在二者之間。初生乳管呈不規則分布，主要在維管束韌皮部一側中，極少數分布在皮層和髓狀的基本組織中。統計維管束韌皮部一側中初生乳管所占的面積比例來代表小葉柄中初生乳管的分化能力。

對182份野生種質的統計分析表明，這些野生種質小葉柄中初生乳管的面積比都在3%以內，按照每間隔0.5%的區間劃分成6個區段，其中面積比在2.5%～3%區間的的種質僅有1個，為RO/CM/11 63/418（圖1-A）；面積比在2%～2.5%的種質有2個，分別為RO/PB/1 2/157和MT/C/7 8/43；面積比在1.5%～2%的種質增多為13個，其他166個種質的面積比例均在1.5%之下。在這166個種質中，面積比為1%～1.5%的種質有40個；面積比在0.5%～1%區段的種質最多，有74個；面積比在0.5%以下的種質仍然有52個，其中最少的是RO/CM/11 63/204，不到0.1%（圖1-B）?？梢?，野生種質中小葉柄初生乳管所占的面積比例總體偏低（圖1-C），表明乳管分化能力高的種質較少。

2.2 莖皮中初生乳管分化

幼莖進行初生生長形成的乳管都是初生乳管。初生乳管緊靠次生韌皮部的外方分布，看起來像是初生韌皮部的一部分，但其發生與初生韌皮部沒有聯系[10]。初生乳管排列不規則，統計數目困難，所以統計了從次生韌皮部的外側到初生韌皮纖維帶之間的初生乳管所占的面積比例。結果表明，野生種質的莖皮中初生乳管面積比最高為13.3%，代表種質為RO/CM/11 63/361（圖2-A），面積比例最低的為1.3%，代表種質為7/02/81 1/7（圖2-B）。由于面積比例10%以上的種質較少，僅有5個，則劃歸為一個區段；10%以內的種質有177個，則按照每間隔2.5%劃分為4個區段，其中面積比為7.5%～10%的種質有30個；面積比為5%～7.5%的種質有81個，屬于種質最多的區段；面積比為2.5%～5%的種質有62個；而面積比小于2.5%的種質僅有4個?？梢姡谇o皮中，面積比例高的種質也較少（圖2-C）。由于橡膠樹萌條中莖皮所占據的生物量遠小于葉，所以后續比較分析中主要以代表葉乳管分化能力的小葉柄的數據進行。

2.3 莖皮和小葉柄中初生乳管分化能力的比較

對同一種質中莖皮和小葉柄兩個不同的部位的初生乳管分化能力進行比較分析，結果表明，二者之間沒有明顯的對應關系。種質RO/CM/11 63/361在莖皮中初生乳管的面積比例最大，為13.3%，但小葉柄中只有0.8%，低于野生種質中的平均水平（圖3-A，B）； MT/C/7 8/43莖皮中僅有3.8%，遠低于平均水平；但小葉柄中初生乳管的面積比例高達2.2%（圖3-C，D）。小葉柄和莖皮中初生乳管分化能力都較強的種質是灌木化栽培的首選，但在這182份野生種質中未能直接篩選到這種類型的種質。

2.4 巴西橡膠樹不同州野生種質葉片中初生乳管分化能力差異分析

1981IRRDB野生種質引自巴西亞馬孫河流域不同的州，對這些來自不同區域的野生種質小葉柄初生乳管分化能力進行比較分析，結果表明，選自巴西朗多尼亞州（RO/）初生乳管分化能力強的野生種質數量最多，其中乳管面積比在1%以上的種質占該州的55.1%，并且有2個種質的乳管所占面積比達到2%以上，而低于0.5%面積比例的種質很少，僅約10%（圖4-A）；阿克里州（AC/）其次，乳管面積比值在1%以上的種質占該州的38.7%，但低于0.5%面積比例的種質數量也增多至該州的22.5%（圖4-B）；來自馬托格羅索州（MT/）的野生種質初生乳管分化能力普遍較差，雖然有少數種質有良好表現，面積比例在1.5%以上的種質有6個，占該州50份種質中的12%，但面積比例在1%～1.5%的種質僅1份，占2%，而面積比0.5%～1%區段的種質有23個，占46%；0.5%以下區段的有20個，占40%（圖4-C）；對于來自其他非主選區域的野生種質初生乳管分化能力最弱，沒有面積比例1.5%以上的種質，1%～1.5%也僅有3個種質，占所選34份種質中的8.8%，余下種質面積比皆在1%以下（圖4-D）。由此可見，來自不同地域的種質乳管分化能力存在差異，朗多尼亞州（RO/）可能更容易篩選到優良的種質，這些結果為以后種質的引進以及篩選提供參考。

3 討論

巴西橡膠樹大樹樹干中的次生乳管是產排膠的主要組織，可再生的產排膠特性決定了其采膠方式是進行有規劃的切割樹皮。次生乳管的數量、兩次割膠之間的膠乳再生能力以及排膠時間是限制天然橡膠產量的3個主要因子[11-23]。目前的割膠生產只與次生乳管相關，所以長期以來，我國選育種工作主要是針對次生乳管的各種特征進行[24]。除次生乳管外，橡膠樹的嫩枝、葉中含有另一種類型的乳管，即初生乳管，其中同樣含有大量的膠乳，但因與采收沒有直接關系，所以對其研究較少，針對初生乳管產膠潛力的選育種則未見報道。鑒于我國當前天然橡膠自給率嚴重不足，膠工老齡化、短缺等產業發展現狀[25]，天然橡膠產業急需結構性改革。對巴西橡膠樹進行灌木化栽培，借鑒銀膠菊[26]實現機械化采膠，可能是未來的一個可行的生產模式，篩選適合這種模式的種質是首要條件。

1981IRRDB野生種質引自巴西亞馬孫河流域，是較魏克漢種質晚期引進的種質，具有更為廣泛的遺傳基礎[18-19， 27]，對該種質的主要性狀進行鑒定、評價是選育種的重要基礎?；诠嗄净耘嗟哪康模x育種的主要目標不再是次生乳管而是莖、葉中的初生乳管。由于葉片的生物量遠大于莖皮，我們對于苗期乳管分化的研究主要著眼于葉，同時考慮莖皮。小葉柄中的乳管因與葉片和大葉柄中的相連，通常被認為是能穩定代表葉片乳管分化情況的部位，但已有的小葉柄中初生乳管的統計是以個數來進行的[20， 28-29]，而初生乳管在排列上不規則，且乳管之間有接合管相連[10]，統計個數存在不準確的問題。另外，初生乳管的大小也存在差異，僅以個數很難代表初生乳管的產膠潛力。本文中借助Image J圖形處理軟件，能很好的統計切片中不規則圖形的面積。小葉柄中在皮層的基本組織、維管束及居中的假髓的基本組織中都可能有初生乳管[28]，但主要分布在維管束中并最為穩定，本文中首次通過統計小葉柄中初生乳管占據維管束木質部外側的面積比作為乳管分化能力的指標，對182份1981IRRDB野生種質的初生乳管分化進行了研究，能更準確地反應不同種質苗期的乳管分化能力和產膠潛力。

本研究表明，小葉柄和莖皮中的初生乳管分化在不同的種質中存在明顯的差異。雖然幼嫩莖皮和葉片中最初分化的初生乳管存在相連的情況[10]，但我們觀察到在這兩個部位中的初生乳管分化能力并不完全一致。RO/CM/11 63/361在莖皮中初生乳管的面積比例最大，但小葉柄中低于野生種質中的平均水平；MT/C/7 8/43小葉柄中初生乳管面積比例接近最高值為2.2%，但莖皮中僅有3.8%，遠低于平均水平。在本研究的182份種質中未檢測到莖皮和葉兩個部位乳管分化能力都強的種質，供給商品化生產栽培的品種可能還需要進一步的選育。

1981IRRDB野生種質主要來自朗多尼亞州（RO/）、阿克里州（AC/）和馬托格羅索州（MT/）三大州。本研究中對來自三大州的種質分別選了近50份，從其他非主選區選擇了34份種質進行區域對比。結果表明來自不同地域的種質乳管分化能力存在差異，朗多尼亞州（RO/）乳管面積比例高的種質更多，可能更容易選育到優良的種質，同時該州中具有乳管分化能力最高和最低這兩種極端的種質，表明其種質的遺傳背景更富于多樣性。

本文從初生乳管分化能力的角度對來自不同區域的野生種質初步進行了鑒定和評價，為以后種質的引進、篩選及適合灌木化栽培種質的選育提供參考。

致謝 本研究所用橡膠樹種質由國家農作物種質資源平臺-國家橡膠樹種質資源子平臺提供，胡彥師副研究員在野生種質識別上提供了專業支持。

參考文獻

[1] Yeang H Y， Arif S M， Yusof F， et al. Allergenic proteins of natural rubber latex[J]. Methods， 2002， 27： 32-45.

[2] dAuzac J， Prevot J C， Jacob J L. Whats new about lutoids？ A vacuolar system model from Hevea latex[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 1995， 33（6）： 765-777.

[3] Kongsawadworakul P， Viboonjun U， Romruensukharom P， et al. The leaf， inner bark and latex cyanide potential of Hevea brasiliensis： Evidence for involvement of cyanogenic glucosides in rubber yield[J]. Phytochemistry， 2009， 70： 730-739.

[4] Gomez J B. Comparative ultracytology of young and mature latex vessels in Hevea brasiliensis[C] // Rubber Research Institute Malaysia， Proceeding of the International Rubber Conference.1975， Kuala Lumpur， 1976： 143-164.

[5] dAuzac J， Jacob J L， Chrestin H. The Laticiferous cell and latex-A model of cytoplasm[C] // Physiology of Rubber Tree Latex. Boca Raton： CRC Press， 1989： 59-98.

[6] Hao B Z， Wu J L. Laticifer differentiation in Hevea brasiliensis： induction by exogenous jasmonic acid and linolenic acid[J]. Annals of Botany， 2000， 85： 37-43

[7] Wu S H， Zhang S X， Chao J Q， et al. Transcriptome analysis of the signalling networks in coronatine induced secondary laticifer differentiation from vascular cambia in rubber trees[J]. Scientific Reports， 2016， 6： 36384. doi： 10.1038/srep36384.

[8] 田維敏， 史敏晶， 譚海燕， 等. 橡膠樹樹皮結構與發育[M]. 北京： 科學出版社， 2015.

[9] 孫 強. 巴西橡膠樹有節乳管組織發育的研究[J]. 廈門大學學報（自然科學版）， 1997， 36（6）： 935-941.

[10] 吳繼林， 譚海燕， 曾日中， 等. 巴西橡膠樹初生乳管分化與苗生長的關系[J]. 熱帶作物學報， 2000， 21（4）： 1-6.

[11] Gomez J B. Anatomy of Hevea and its influence on latex production[Z]. Kuala Lumper： Malaysia Rubber Research and Development Board， Monograph No.7， Rubber Research Institute Malaysia， Kuala Lumpur， 1982.

[12] 魏小弟.我國割膠生產技術現狀和建議[J]. 中國熱帶農業， 2010（33）： 5-6.

[13] 鐘 勇. 海南橡膠種植業發展前景分析[J]. 熱帶農業科學，2016， 36（8）： 69-75

[14] 高宏華， 黃云生， ?，F周， 等. 淺議機械化采割的緊迫性和可行性[J]. 中國熱帶農業， 2015（65）： 10-13.

[15] 鐘淦彬， 李維國， 吳春太，等. 188份巴西橡膠樹種質材料AFLP 指紋圖譜分析[J]. 熱帶作物學報， 2013， 34（1）： 1-9.

[16] 劉松泉.巴西橡膠的生產形勢和選育種工作[J]. 云南熱作科技，1989， 12（3）： 1-8.

[17] 馮素萍， 李維國， 于 飛， 等. 巴西橡膠樹SSR遺傳圖譜的構建[J]. 遺傳， 2010， 32（8）： 857-863.

[18] 曾 霞， 胡彥師， 方家林， 等. 橡膠樹 1981IRRDB野生種質主要性狀鑒定—1986-1994年大田鑒定區[J]. 植物遺傳資源學報， 2007， 8（1）： 35-40.

[19] 龍翔宇， 何 斌，王 闖， 等. 橡膠樹1981IRRDB 野生種質及栽培品系ITS序列多態性及其進化分析[J]. 熱帶作物學報， 2015， 36（12）： 2 113-2 119

[20] 郭祁源， 周鐘毓， 詹賽榮， 等. 巴西橡膠樹苗期產量測預方法第二次驗證報告（1982～1994）[J]. 熱帶作物研究， 1995（2）：9-13.

[21] 周鐘毓， 袁燮輝， 郭祁源， 等. 巴西橡膠樹產量苗期測預方法及其理論依據的研究[J]. 熱帶作物學報， 1982， 3（2）： 1-16.

[22] 史自強， 胡正海. 植物含膠組織的制片方法[J]. 植物學報，1965， 13（2）： 179-182.

[23] Hao B Z， Wu J L. Biology of laticifers in Hevea and latex production[J]. 熱帶作物學報， 2004， 25（4）： 1-7.

[24] 黃華孫. 中國橡膠樹育種五十年[M]. 北京： 中國農業出版社， 2005.

[25] 陳明文. 我國天然橡膠產業發展形勢與因應策略[J]. 農業經濟問題， 2016（10）： 91-94.

[26] 龐廷祥， 程儒雄， 倫華文， 等. 銀膠菊引種試種研究報告[J]. 熱帶農業科學， 2007， 27（1）： 1-11

[27] 周鐘毓. IRRDB非洲三葉橡膠種質中心1981年種質收集情況[J]. 熱帶作物譯叢， 1987（2）： 1-5

[28] 周鐘毓， 黃 香， 詹賽榮， 等. 橡膠樹乳管系與產量早期預測關系的研究[J]. 熱帶作物學報， 1984， 5（1）： 29-36.

[29] 黃 香， 韋禮貞， 詹賽榮， 等. 橡膠苗期葉部乳管系與-產量早期預測關系的初步研究[J]. 熱帶作物學報， 1981， 2（1）： 16-20.