利用SSR分子標記研究白菜類亞種資源的遺傳多樣性

李光光　黃紅弟　張華　鄭巖松　李榮華

摘 要 為研究幾種白菜類亞種資源的演變過程，利用白菜SSR引物對94份白菜類亞種種質資源進行遺傳多樣性分析。結果表明，19對SSR引物擴增出137個條帶，平均每對引物可擴增出7.16個；多態性位點百分率（P）、基因雜合度（He）、有效等位基因數（Ne）、Shannon-Wiener指數（H）和多態信息含量（PIC）的均值分別為：99.9%、0.897、11.598、2.454、0.886，除P值外，4個指標間相關性極顯著；94份白菜類亞種種質資源的UPGMA聚類結果表明：在遺傳相似系數為0.58時實驗材料分為3類，多數地方種菜心與小白菜親緣關系更近。白菜SSR引物對大（小）白菜基因組具有較好的多態性、紅菜苔次之、野生芥菜最低。

關鍵詞 白菜類亞種資源；SSR；遺傳多樣性；親緣關系

中圖分類號 S330 文獻標識碼 A

Abstract In order to analyze the evolution of Chinese cabbage[ssp. chinensis（L.）Makino]resource， a total of 94 Chinese cabbage[ssp. chinensis（L.）Makino]materials were used to assess the genetic diversity. The results showed that， nineteen cabbage SSR primers combinations amplified 137 alleles， 7.16 loci on average for each pair of primers. The average of polymorphism loci percentage（P）， genetic heterozygosity（He）， effective number of alleles（Ne）， Shannon-Wiener index（H）and polymorphism information content（PIC）was 99.9%， 0.897， 11.598， 2.454， 0.886， respectively， and there were extremely significant correlation among them except P value. 94 Chinese cabbage[ssp. chinensis（L.）Makino]materials were clustered into three groups by UPGMA when GSC was 0.58， much of local Chinese cabbage was closer relationships with pakchoi. The order of genome amplification polymorphism by Chinese cabbage SSR primers was（small）cabbage， red bolt second lowest and wild mustard.

Key words Chinese cabbage[ssp. chinensis（L.）Makino]resource； SSR； genetic diversity； genetic relationship

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.021

蕓薹屬白菜類蔬菜[Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. communis Tsen et Lee]為A基因組，除了大白菜外，其亞種有5個變種：普通白菜變種（var. communis Tsen et Lee）、烏塌菜變種（var. rosularis Tsen et Lee）、菜薹變種（var. utilize Tsen et Lee）、紫菜薹變種（var. purpurea Bailey）及薹菜變種（var. tai-tsai Hort），經過自然及人工選擇形成了類型豐富的群體。普通白菜變種中的不結球白菜（Brassica rapa L. ssp. chinensis Makino）及菜薹變種中的菜心（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee）多數起源于華南地區，具有生長期短、適應好及營養好等特點，經過長期的種植及選擇，在華南地區產生了不同的地方種資源及商品種材料。相關研究對一些白菜類資源已進行了分類及遺傳多樣性研究，但由于白菜類作物屬于異花授粉類型，較高的異交率及地方長期選擇后，逐漸在形態、生長發育等方面出現較為復雜的變異，不利于該類資源的創新利用。

種質資源是遺傳育種選育的材料來源，對農業生產及品種創新具有重要意義。白菜類蔬菜作物的品種鑒定、遺傳多樣性及親緣關系的鑒定報導多是利用RAPD、SRAP、ISSR、SSR、MFLP等[1-5]，由于SSR為共顯性分子標記技術，操作簡單，重復性好，可隨機、均勻的分布在擴增的基因組內，被普遍用于遺傳圖譜的構建、基因定位、遺傳多樣性和指紋譜圖的繪制[5]。根據基因組遺傳信息開發出的SSR引物，對于屬內作物，還具有一定的通用性，有利于同屬的作物的資源評價分析，并對研究屬內群體的性狀演化起到借鑒作用。

目前分子標記技術多是針對白菜類作物的商品種進行研究，對群體內的自交系本身及自交系與商品種之間的演變研究還未見報道。本試驗利用開發出的19對大白菜基因組SSR引物，對白菜類亞種資源群體內結構特點及遺傳多樣性進行分析，以期為白菜類亞種作物進行育種材料的遺傳改良、基因庫的構建提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

94份試驗材料（表1）均為菜心課題組改良的中間材料及在種子市場購買的商品種和田間收集的地方種，所有材料均種植在廣州市農業科學研究院花都試驗基地，常規田間管理。

1.2 方法

改良CTAB 法提取試驗材料嫩葉中的DNA，PCR反應體系組成及擴增過程按照張婉等[6]方法，銀染檢測6%聚丙烯酰胺凝膠電泳結果。0-1記錄條帶的有無，計算各引物下的多態性百分率，NTSYS-pc 2.10e軟件分析0-1矩陣，通過UPGMA法生成聚類圖，構建白菜類亞種資源的遺傳多樣性。

按照張超等[7]方法計算遺傳多樣性相關指標，獲得雜合度（He）、有效等位基因數（Ne）、Shannon-Wiener指數（H）、多態性位點百分率（P）、多態信息含量（PIC）等相關信息。

2 結果與分析

2.1 白菜SSR引物多態性分析

利用19對白菜SSR引物對94份白菜類蔬菜基因組DNA進行擴增，獲得了137個條帶，多態性條帶占總條帶的99.27%。每個引物可擴增得到多態性條帶3～12個、平均7.16個，說明94份參試材料的遺傳信息較多，見圖1（A-B）。

2.2 遺傳多樣性指標分析

試驗材料的多態性位點百分率（P）為97.5%～100%，多態性>50%，表明19對白菜基因組SSR引物能擴增出豐富的遺傳信息；基因雜合度（He）均值為0.897，變化范圍為0.729～0.948；有效等位基因數（Ne）為11.598，變化范圍為3.694～19.354；Shannon-Wiener指數（H）均值為2.454，變化范圍為1.409～3.010；多態信息含量（PIC）均值為0.886，變化范圍為0.680～0.946，這些遺傳多樣性指標均表明參試白菜類蔬菜群體的遺傳多樣性較強（表2）。

遺傳多樣性指標相關性分析表明（表3），多態性位點百分率P與其它指標之間無任何顯著性相關，說明P值可以描述引物擴增的多態性，但不能對試驗群體的遺傳信息豐富度進行說明；而擴增帶數、He、Ne、H相關性非常顯著，這些指標可以對白菜類蔬菜種質資源的多樣性進行描述。

2.3 SSR標記的遺傳相似性分析

0-1矩陣的相似性分析結果（圖2）表明，94份白菜類蔬菜遺傳相似性系數為0.321～0.927，平均相似性系數為0.624、基本上與遺傳系數的跨度距離相當；遺傳系數0.50～0.75的范圍內包含了86.02%的白菜類蔬菜，說明這些蔬菜親緣關系較近，可以進行種內/間雜交來擴大種質資源的利用效率。

2.4 白菜類蔬菜的聚類分析

利用UPGMA對試驗材料的遺傳相似系數進行聚類，結果（圖3）表明，在遺傳相似系數為（GSC）0.58時分為3類。第Ⅰ類中包括群體ⅰ的小白菜C63（563小白菜）和C64（甜脆小白菜）相似性系數為0.766，說明兩者多數性狀相同，可能具有相同的親本來源；群體ⅱ有小白菜、紅菜苔及大白菜多個類型，說明白菜基因組SSR引物在這個群體中具有一定的遺傳信息基礎；群體ⅲ為地方種菜心類型（如C13連州菜心、C22增城一號遲菜心），說明這些材料起源于小白菜類，而遺傳信息比小白菜類較少，可能是人工選擇導致性狀改變。

第Ⅱ類群體聚類先后為小白菜、紅菜苔及野生芥菜，說明這幾個材料的基因組所攜帶的保守信息有數量上的差異，選用的SSR引物對小白菜基因組具有較好的多態性、紅菜苔次之、野生芥菜最少。第Ⅲ類有大白菜、小白菜、菜心、紅菜苔及烏塌菜，與C20（桂林卷葉甜脆）較近的C85（矮腳束腰青江白）、C86（矮腳奶白菜）聚在一起，說明地方種菜心具有的遺傳信息較多，且起源于小白菜，而地方種菜心C21（十月柳-4-2-2）即使經過低代自交仍然與小白菜C79（白王白菜）、C80（玉兔黑葉白）聚在一起；具有相同親本的C24（遲2-1-4-2-2）與C32（遲2-1-4-1-2-2-2），C23（遲4-1-3-5）、C33（遲4-1-3-1-6-3-1-2）與C54（遲4-1-3-5-2-3-2）等并沒有聚在一起，表明菜心的變異性較高，人工選擇會產生明顯的遺傳信息缺失；商品種的C11（中南尖葉甜）與C12（金船尖葉甜）、C14（尖葉菜心50天）與C15（4560菜心）、C6（穗美60 d）與C7（穗美碧綠甜）遺傳相似性非常接近，說明這些品種有相同親本來源，或者本質上即為相同的品種而名稱不同；另外其他商品種菜心及育種中間材料較為分散，與大（小）白菜都有聚類，說明經過人工改良的菜心遺傳信息較為復雜。

3 討論

3.1 白菜SSR引物在白菜類蔬菜基因組的擴增應用

相對于經濟作物，白菜類蔬菜SSR引物標記基本上來源于大白菜和小白菜（普通白菜變種），而近緣物種的引物在同屬、甚至種間（內）具有一定的通用性，可用來進行遺傳多樣性分析。不結球白菜SSR引物在大白菜、四倍體白菜、烏塌菜、芥菜等蔬菜的通用性擴增率均在63%以上[8]；34對大白菜SSR引物在6個白菜（包括大白菜、小白菜、菜心等）品系中有效擴增率為82.35%，在甘藍、油菜和蘿卜中的成功擴增率分別為85.71%、100%和77.78%[9]。這與本實驗利用19對白菜基因組SSR引物對白菜類蔬菜及野生芥菜的均可獲得擴增條帶（通用性擴增率為100%）的結果基本一致；而擴增條帶數量不一，說明白菜類亞種基因組間存在一定的保守信息。

3.2 白菜類蔬菜的遺傳多樣性分析

對94份白菜類蔬菜基因組進行SSR擴增，獲得平均多態性位點百分率為99.9%，且遺傳相似性系數為0.321～0.927，群體內的遺傳差異很大，說明試驗群體攜帶有很高的遺傳多樣性信息。6個遺傳多樣性指數方差分析表明：除了多態性位點百分率P外，擴增帶數、He、Ne、H相關性非常顯著，這與李光光等[10]結果基本一致，這說明P可以描述引物的遺傳信息，但卻不能對試驗群體進行準確描述。試驗得到的Ne與擴增條帶數相差0.394～9.354，相差較大，表明群體遺傳變異較大[11-12]；基因雜合度（He）較大說明遺傳變異的大、選擇潛力強[13]；多態信息含量（PIC）>0.5時，表明群體有高度多態性位點[14-15]；Shannon-Wiener指數（H）越大，對于其中繁衍和保護物種多樣性的能力越強[16]。He為0.729～0.948、PIC為 0.680～0.946、H為1.409～3.010，表明本試驗群體內所選用的材料變異幅度較大、類型多樣，且可用于選擇的潛力較高、群體多樣性很強，有利于資源的創新利用。

3.3 白菜類亞種資源的聚類分析

白菜類蔬菜類型較多，利用分子標記對其群體進行關聯作圖來分析其結構組成[17]，是資源利用的重要步驟之一。94份白菜類亞種資源存在遺傳相似性系數0.35以下的材料，說明群體的類型組成較為豐富，有利于白菜類亞種蔬菜資源的創新利用。

第Ⅰ類中的群體ⅲ基本上將地方種菜心都聚在一起，說明來源于白菜基因組的SSR引物能較好的反映群體的遺傳組成，地方種菜心的起源更接近于小白菜，這與地方種增城遲菜心更接近于紫菜薹類型喬燕春等[18]的結果不盡一致，可能是其表型性狀的調查標準偏差影響了總體的聚類分析。第Ⅱ類群體的聚類順序說明同屬的SSR引物能對親緣關系較近的材料基因組擴增出的遺傳信息較多，亞種變種次之，屬內擴增的最少。第Ⅲ類基本上將試驗材料類型都聚在一起，其中屬于華南地方種菜心與小白菜聚在一起，與第Ⅰ類中的群體ⅲ上的聚類結果一致，說明地方種更趨向于普通白菜，經低代自交后，遺傳信息變化不大；而經多代人工自交選育的商品種菜心，與大（小）白菜聚類沒有明顯的規律，說明商品種菜心的遺傳關系較為復雜。

野生二倍體蕓薹屬B. rapa（2n=20，AA）經自然選擇及人工馴化栽培形成了資源類型豐富的白菜類作物，一般認為先形成不結球的小白菜，再經過長期的選擇更形成了塌菜等5大形態不同的變種[19]；另外野生芥菜（B. juncea）也是由野生B. rapa演化為而來的異源四倍體次生種，這些作物在形態上的差異較大，但由于具有較高的異交率，會使遺傳信息在一定程度上得到保留。本實驗包括大（小）白菜、菜心、紅菜薹、烏塌菜、野生芥菜5個類型的蕓薹屬材料，94份白菜類蔬菜聚為3大類，各類組成沒有明顯的群體結構，說明白菜類亞種資源在自然及人工作用下，可以較為容易的實現遺傳物質的轉移，為擴大性狀的遺傳改良提供了豐富的資源基礎。

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