針刀對膝關節骨性關節炎模型兔的實驗研究

劉廣宇 張曉峰

摘要 目的：觀察小針刀對兔膝骨性關節炎模型組織形態及其關節軟骨MMP-9及COX-2的變化。方法：將30只新西蘭兔隨機分為假手術組、模型組、針刀組，各10只。其中模型組及針刀組接受KOA模型制作，假手術組及模型組不接受任何干預措施，針刀組在造模第2天起利用針刀以縱疏、橫剝法為手法對膝關節內外側副韌帶及髕尖下正中點進行松解，每周1次，共治療4周，每周每只兔子右膝關節內注射丹參注射液0.6 mL，連用4周（增加丹參注射液的使用）。治療結束后光鏡下觀察3組兔膝關組織形態變化，并用Western blotting法關節軟骨MMP-9及COX-2濃度變化。結果：1）HE染色后模型組、針刀組新西蘭兔膝關節均有不同程度的水腫、增生，其中針刀組較模型組改善；此外模型組膝關節軟骨還可見一定程度退行性改變。2）與假手術組比較，模型組及針刀組兔膝關節軟骨MMP-9及COX-2濃度均升高，其中模型組升高的趨勢更明顯（P<0.05），針刀干預后針刀組上述兩指標水平較模型組下降（P<0.05）。3）使用Pearson法進行MMP-9、COX-2濃度變化的相關性分析，結果發現兩者呈正相關關系，結論：針刀松解術可明顯改善膝關節骨性關節炎模型兔軟骨退變，其機制可能與降低MMP-9及COX-2有關。

關鍵詞 膝關節骨性關節炎；KOA；針刀；MMP-9；COX-2

Abstract Objective：To observe acupotomy on the morphology of knee osteoarthritis rabbits model and the changes of MMP-9 and COX-2 in the articular cartilage. Methods： Thirty New Zealand rabbits were randomly divided into a sham-operate group， a model group and an acupotomy group， 10 models in each. The model group and the acupotomy group were made into KOA model， while the sham-operate group and then model group didn′t accept any interventions. The acupotomy group released the lateral collateral ligament and the patellar ligament on the second day of molding by acupotomy with vertical and horizontal strip method， once a week， for 4 weeks′ treatment. After the treatment， knee histomorphology changes under light microscope of the three groups of rabbits were observed， and concentration changes of articular cartilage MMP-9 and COX-2 were tested by Western blotting. Results： 1） After HE dyeing， the model group， the acupotomy group of New Zealand rabbits′ knees all have different degrees of edema and hyperplasia， and the improvements in the acupotomy group was better than that in the model group； a certain degree degenerative changes were also visible in the knee joint cartilage of the model group. 2） Compared with the sham-operate group， MMP-9 and COX-2 concentration of articular cartilage increased in both of the model group and the acupotomy group， but the increasing trend of the model group was more obvious （P<0.05）. After acupotomy intervention， the above two index levels in the acupotomy group dropped more than those in the model group （P<0.05）. 3）Using Pearson method to analyze MMP-9 and COX-2 correlation， the results showed that MMP-9 levels was positively correlated with COX-2 （P<0.05）. Conclusion： Acupotomy can improve cartilage degeneration of the knee osteoarthritis of model rabbits obviously， and the mechanism maybe related to the reduction of MMP-9 and COX-2.

Key Words Knee osteoarthritis； KOA；Acupotomy； MMP-9；COX-2

中圖分類號：R245文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.06.050

膝骨性關節炎（Osteoarthritis，OA）是中老年人常見骨關節疾患，以關節軟骨退變及骨贅生成為主要病理特征[1]。隨著我國老齡化社會的到來，OA患者日趨增多，目前針對OA的療法有保守治療及手術治療2大類，其中藥物為主的保守治療雖可達到一定療效，但西藥的易耐受及中藥的療程長均影響患者的依從性，手術療法易出現手術殘留，對患者身心創傷較大，故一種療效持續、不易耐受、安全性高的治療手段呼之欲出。小針刀結合中醫的“針”及西醫的“刀”，對膝關節周圍的肌腱韌帶等軟組織的粘連、攣縮和瘢痕等可行橫向剝離和縱向疏通，沒有嚴格適應癥，費用較手術費用低。因此本研究以KOA模型新西蘭兔為研究對象，旨在觀察小針刀對OA的療效及作用機制。現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 取30只新西蘭兔，平均體重（2.2±0.18）kg，所有動物均由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供，飼養環境設置：室溫23～25 ℃，相對濕度（56±6）%。

1.1.2 試劑與儀器 針刀（0.4×0.4 mm漢章醫療器械有限公司），樹脂繃帶（安平縣康利醫療器械有限公司），乙醇（岳陽市君華化工有限公司），蘇木素（上海生工生物有限公司），超凈工作臺（蘇州安泰公司），PI3K、AKT、β-acting抗體、鼠抗兔HRP-二抗（CST公司），二甲苯（上海泰正化工有限公司），石蠟（濟南鑫厚商貿有限公司），切片機（FS/FAS5030石蠟切片機，德國LETIZ公司），電泳液（碧云天公司），轉膜液（碧云天公司），配膠試劑盒（碧云天公司），酶標定量測定儀（Thermo Multiskan AsCant公司），可調控溫度離心機（Eppendorf公司）。水合氯醛（武漢遠成共創科技有限公司），丹參注射液（正大青春寶藥業有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 30只新西蘭兔隨機分為假手術組、模型組及針刀組，各10只。模型組及針刀組兔接受Vidman法進行KOA模型的制作，將動物用10%水合氯醛以0.3 mL/kg進行麻醉固定牽拉，使動物處于完全伸直狀態，將樹脂繃帶置于（70±5）℃環境下進行浸泡軟化，固定于動物腹股溝至腳踝處，使膝關節保持伸直180°狀態，從動物足趾處觀察血供情況，共制動4周，制動結束后從模型組及針刀組隨機選取2只動物進行影像學及形態學評估，提示造模成功后拆除動物樹脂繃帶。造模過程中若動物出現皮膚感染、肢體潰爛壞死等均予剔除。所有動物置12/12晝夜交替燈光周期。

1.2.2 干預方法 假手術組及模型組兔不接受任何干預手段，回籠飼養。針刀組兔接受小針刀松解術，具體操作如下：造模成功后1周對兔進行針刀松解術，先將兔麻醉后利用龍膽紫藥水標注進針點，以內外側副韌帶及髕尖下正中點為進針點，1）內外側副韌帶：刀口線平行于韌帶，并以韌帶中點為進針處，刀體垂直于皮膚迅速刺入直達韌帶，分別向韌帶起止點方向進行松解；2）髕尖下正中點：刀口線平行于髕韌帶，刀體垂直快速刺入皮膚，直入脂肪墊，縱向、橫向疏通剝離1～3刀，然后將刀體呈45°向下傾斜，刀口深入直達髕骨下極，縱向、橫向剝離1-3刀，將脂肪墊與髕骨下緣的粘連徹底松解，刀下有松動感后出刀。在內外側副韌帶及髕尖下正中點進針時均采用縱疏橫剝離等手法，治療結束出針時即刻按壓數分鐘，每周治療1次，共治療4周。每周每只兔子右膝關節內注射丹參注射液0.6 mL，注射后屈伸膝關節20次，連用4周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 一般情況觀察評定 干預結束后對各組新西蘭兔一般情況進行觀察，主要包括動物的反應性、攝食及攝水量，皮毛生長情況及光澤度，肢體活動度，步態。見表1。

1.2.3.2 取材固定 所有動物在治療結束1周采用空氣栓塞法處死，處死后將動物置于超凈工作臺冰面上，快速取出造模側股股外側髁處新鮮軟骨2塊，大小均約1×1 cm，標本A快速置于福爾馬林中進行固定，標本B置于5%硝酸溶液。標本A固定一周后取出進行常規石蠟包埋、切片，染色，后在光鏡子下觀察形態學情況。標本B脫鈣15 d后取出，用PBS沖洗2次，10 min/次，后置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.3.3 Western-blot檢測MMP-9及COX-2的表達 將收集的EPCs細胞收集加入100 μL裂解液進行細胞分裂，放入4 ℃振蕩器中持續震蕩30 min，并將液體用移液槍轉移至事先預冷離心管，再次置于4 ℃離心機中以5 000 r/min轉速進行離心15 min，用移液槍將上清液抽取至新的離心管中備用。利用BCA試劑盒測定蛋白濃度，并在100 ℃水浴中進行蛋白變性7 min，并計算上樣量。事先配制好SDS-PAGE膠體，用移液槍將蛋白加之膠體中進行電泳，隨后將蛋白轉移至硝酸纖維膜上，隨后用脫脂奶粉進行封閉2 h，用PBS清洗2次，10 min/次，加加1∶500稀釋的一抗（MMP-9及COX-2）及內參抗體（β-acting，1∶3 000）室溫孵育2 h，用PBS清洗2次，10 min/次，隨后加入辣根過氧化酶HRP-二抗，室溫下輕搖2 h取出繼續PBS清洗2次，10 min/次，最后利用ECL顯影，拍照，統計分析。

1.3 統計學方法

應用SPSS 21.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩樣本均數采用t檢驗，兩等級資料進行秩和檢驗，計數資料進行χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組兔一般情況比較 造模后假手術組動物精神情況良好，攝食正常，四肢活動度及反應性較靈敏，且皮毛旺盛有光澤。模型組及針刀組動物造模后均出現不同程度精神疲乏，對外界的刺激反應較造模前減弱，膝關節僵硬活動度差，皮毛較亂且光澤減弱，經過為期4周的針刀干預后針刀組實驗兔上述情況有明顯改善，但與假手術組比較仍存在膝關節活動度較差，步行稍跛行的現象。

2.2 各組組織形態學變化情況 假手術組膝關節軟骨形態未發生變化，軟骨表面結構及厚度均正常，軟骨細胞排列均勻有序，潮線清晰可見。模型組膝關節軟骨表面粗糙，厚薄不均，完整性受破壞，軟骨細胞不同程度壞死，細胞排列錯亂，潮線扭曲斷裂甚至重疊。針刀組形態學較模型組有明顯改善，但仍可見軟骨表面些許破壞，軟骨細胞存在一部分排序紊亂，血管數量較模型組增加，偶可見潮線重疊。見圖1。

2.3 各組MMP-9及COX-2蛋白表達的變化 與假手術組比較，模型組及針刀組兔膝關節軟骨MMP-9及COX-2濃度均升高，其中模型組升高的趨勢更明顯（P<0.05），針刀干預后針刀組上述兩指標水平較模型組下降（P<0.05）。見表2、圖2。

2.4 相關性分析 使用Pearson法進行MMP-9、COX-2濃度變化的相關性分析，結果發現I兩者呈正相關關系。見表3。

3 討論

20世紀30年代美國研究者Bennett等利用狗髕骨脫位法復制出OA模型，之后Pond及Nuki將實驗狗前交叉韌帶切斷，制備出著名的Pond Nuki OA模型，隨后不斷有研究人員改進OA動物模型，但多數OA模型需手術實現，關節打開后易對關節軟骨及滑膜產生創傷，影響其生化代謝，此外手術可能誘發感染導致關節局部發生一系列病理變化，最終影響實驗數據[2-4]。關節制動可導致關節軟骨發生破壞，這為現代研究人員提供了造模新思路。動物關節制動5～6周可出現OA明顯的特征，實現了最大程度還原疾病情況的目的，同時此造模方法規避了麻醉或手術導致的混雜因素，紀斌平等研究人員均制動動物膝關節理想地模擬了OA的發病過程，基于此本研究亦采用制動新西蘭兔膝關節造模，最大程度避免人為損傷。

小針刀結合中醫理論及西醫外科手術原理，是中醫在現代發展道路上的新產品，中醫“陰平陽秘、精神乃治”的陰陽平衡理論及西醫閉合性松解術是指導小針刀臨床操作的首要方法學。膝關節生理解剖結構復雜，生理動作及關節穩定性主要靠股骨、脛骨、髕骨及其韌帶、肌肉實現，膝關節是人體承受重量最大的關節，其運動姿勢多樣，勢必導致膝關節受損的可能性最大，日久耗損膝關節軟骨變性，甚至壞死，贅骨生成等，其屬于中醫學“骨痹”“痹證”范疇，脈絡瘀阻是其主要病機，因此松解黏連、疏通經絡是其主要治療原則[5]。小針刀的治療點，主要通過觸診，根據中醫治法“病在筋，調之筋”，主要是“以痛為腧”，結合臨床常見治療點，確定內外側副韌帶、髕上正中點為治療點。在本研究中我們發現KOA造模后實驗兔均出現不同程度的臨床癥狀，經過針刀干預后癥狀較模型組明顯改善，這說明針刀以“以痛為腧”理念下有效改善了模型實驗兔的OA的癥狀。我們在進一步形態學檢測后發現，OA模型動物膝關節的軟骨及其滑囊等結果均出現不同程度的病理變化，在光鏡下可見軟骨表面粗糙，厚薄不均，完整性受破壞，軟骨細胞不同程度壞死，細胞排列錯亂，潮線扭曲斷裂甚至重疊，小針刀療法明顯改善了OA的病理學表現，發揮了保護軟骨的效應，這一發現與國內外諸多文獻結果一致[6-11]。

在對針刀作用機制的進一步探析中我們對各組實驗兔關節軟骨的MMP-9及COX-2進行檢測，經過發現MMP-9及COX-2在OA發生后濃度均上調。MMP家族在細胞外基質降解系統中占據重要位置，MMP-9是該家族主要成員，承擔基質溶解的角色，不但對蛋白多糖、層粘連蛋白、纖維結合素等有溶解效應，還可通過原膠原酶作用而滅除I、II、III型膠原的N、C末端肽。此外MMP-9還可激活其家族另一個成員MMP-1，導致膠原病理性降解。本研究中我們發現MMP-9在OA模型中濃度上調，這說明在關節軟骨的高表達導致其周圍細胞外基質降解明顯，從而出現了一系列病理變化[12-14]，而小針刀可一定程度通過松解關節粘連促使MMP-9趨于正常水平，糾正病理改變。我們還檢測了COX-2，其乃一類環氧化酶，與疼痛密切相關，當COX-2被激活后合成增加，進一步參與了機體炎性反應和應激反應，加劇了疼痛癥狀，在研究中我們亦發現COX-2在OA模型動物中有高表達，而隨著針刀治療的繼續，其濃度隨之降低，我們還發現MMP-9及COX-2存在一定相關性，說明小針刀可明顯改善OA，這個可能與通過抑制MMP-9及COX-2表達有關。

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（2017-03-06收稿 責任編輯：徐穎）