高溫脅迫對華石斛幼苗的形態和生理參數的影響

吳姝漪 孟千萬 宋希強 丁瓊 朱婕 余文剛 馬豪治

摘 要 華石斛為海南特有蘭科植物，原產海南海拔1 000 m以上的云霧林或山地雨林。為研究高溫對華石斛生長的影響， 本試驗測定了晝/夜（10 h/14 h）溫度梯度（25/20、30/25、35/30、40/35 ℃）的人工氣候箱中生長1、2、4、8 d以及解除脅迫15 d（恢復生長）后華石斛幼苗的形態和生理生化指標。結果表明：高溫30 ℃和35 ℃處理1 d時，形態和各項生理生化指標變化不顯著，幼苗沒有受到熱害。30 ℃和35 ℃處理2～4 d和40 ℃處理1～2 d時，細胞膜穩定性遭到破壞，導致膜脂過氧化，相對電導率、MDA含量升高，SPAD值下降，此時植物通過增加可溶性糖、可溶性蛋白含量，提高SOD、POD活性進行自我調節。30、35 ℃處理8 d和40 ℃處理4 d時，各項生理指標急劇下降，膜系統和抗氧化酶系統遭到破壞，植物受到嚴重熱害。40 ℃處理8 d時，95%的幼苗褐化死亡。不同處理天數下溫度均與相對電導率和MDA含量呈極強正相關，與SPAD呈負相關。研究認為，相對電導率、SPAD、MDA可作為鑒定華石斛幼苗耐熱性的參考指標。

關鍵詞 華石斛；熱脅迫；形態變化；生理反應；耐熱性

中圖分類號 S682.31 文獻標識碼 A

Abstract High temperature is a major bottleneck in the cultivation of Dendrobium sinenese habiting the tropical cloud forest or montane rainforest with altitudes above 1 000 m in Hainan Island， China. To investigate how D. sinense responses to heat stress， morphological and physiological indices were measured for the seedlings grown under four temperatures， i.e.， 25/20（control）， 30/25， 35/30 and 40/35 ℃ and a day/night cycles of 10 h/14 h for 1， 2， 4， 8 d， and recovery for 15 d. Our results showed that no significant differences in morphological， physiological and biochemical changes were found in the seedlings under 30 ℃ and 35 ℃ for 1 d， while damage of cell membrane stability， resulting in membrane lipid peroxidation， increased relative conductivity and MDA content， and decreased SPAD value were observed under 30 ℃ or 35 ℃ for 2-4 d or 40 ℃ for 1-2 d. However， the damaged seedlings were still able to recover through increasing the content of soluble sugar and soluble protein， and raising the SOD， POD activities. Severe heat damages on the membrane system and antioxidant enzyme system indicated by sharply decreases in physiological indices were observed in the seedlings under 30， 35 ℃ for 8 days or 40 ℃ for 4 days. When being treated at 40 ℃ for 8 days， 95% of the seedlings turned brown and died. Our studies demonstrated that the relative conductivity and MDA content were positively correlated， while the SPAD value was negatively correlated with temperatures. Therefore， these three values could be used as heat tolerance index of D. sinense seedlings.

Key words Dendrobium sinense； heat stress； morphological change； physiological response； heat tolerance

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.010

華石斛（Dendrobium sinense）原產于海南島中西部海拔1 000 m以上的高山云霧林或山地雨林中，是海南特有蘭科植物，也是傳統黎藥[1]。華石斛全草富含芪類、聯芐類等多類化合物，具有良好的抗菌、抗腫瘤活性[2]。將華石斛引種到氣溫相對較高的低海拔地區栽培過程中發現，持續高溫條件下華石斛植株易出現萎蔫、落葉、褐化甚至死亡，這可能是由于華石斛長期適應海拔較高地區冷涼的生境，從而對環境溫度變化極其敏感[3]，但高溫對華石斛的影響尚未被揭示。

短暫或持續的高溫影響植物的生長和發育，嚴重可導致植物體死亡[4]，植物的熱應激反應引起一系列形態和生理生化的變化從而緩解高溫帶來的脅迫[5]。高溫引發五葉地錦[6]（Parthenocissus quinquefolia）、南蛇藤（Celastrus obiculatus）等植物細胞脫水，葉綠素的生物合成受阻、分解加速，植物葉片的SPAD值降低；萬壽菊（Tagetes erecta）[7]受熱害后細胞原生質膜透性增加，電解質外滲，相對電導率增加；植物在高溫脅迫下通過合成或分解可溶性蛋白和可溶性糖等滲透調節物質，幫助維持細胞的滲透壓，提高對環境的適應性[8]；丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終產物，高溫處理芍藥（Paeonia lactiflora）后，葉片中的MDA含量增加，MDA含量是判斷植物受熱害程度的可靠指標之一[9]；抗氧化酶SOD、POD和CAT等可以在一定范圍內清除高溫脅迫產生的活性氧自由基，降低膜脂過氧化，有效提高植物的耐熱性[10]。

本研究將華石斛幼苗置于不同梯度的人工高溫條件下培養，觀測其外觀形態并檢測生理生化指標的變化情況，擬探究高溫脅迫對華石斛幼苗形態的影響，高溫脅迫對華石斛幼苗生理參數的影響，反映華石斛幼苗耐熱性的主要參考性指標。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2016年6月～2016年9月在海南大學進行。供試材料是通過無菌播種得到的整齊一致的一年生華石斛（Dendrobium sinense）幼苗，株高4～5 cm；具4～6片葉，葉色正常；具1～4條根，根長1～4 cm。

將幼苗帶瓶置于海南大學基地大棚的苗床上自然條件下生長10 d，取出華石斛幼苗，用去離子水輕輕洗去根部的培養基后用1/1 000的多菌靈浸泡3 min，用潔凈的吸水紙將幼苗上的水分吸干。放置1 d后，觀察幼苗根部發白，移栽至10 cm×8 cm ×8 cm的方形塑料容器內，基質采用消毒和腐熟過的陶粒 ∶ 碎樹皮 ∶ 水苔=1 ∶2∶ 1，每盆栽30株。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 實驗材料預處理：處理前先將所有盆栽幼苗置于晝/夜分別為25 ℃/15 ℃，10 h/14 h，相對濕度為80%～85%，光照強度為2 000 lx的人工智能培養箱（HENGZI SPX-250）中預處理10 d。

高溫脅迫試驗：依據海南省氣象局氣象服務中心發布的數據資料[11]和預實驗研究結果，試驗設晝/夜溫度25 ℃/20 ℃、30 ℃/25 ℃、35 ℃/30 ℃、40 ℃ /35 ℃，每個溫度下的幼苗分別于1、2、4、8 d后取出拍照并剪取新鮮葉片供生理生化指標分析，以25 ℃/20 ℃為對照。每個處理3盆共90株苗，取樣時每盆隨機取15株幼苗，剩余幼苗做好標記放入培養箱，條件同預處理，做高溫脅迫后的恢復。

恢復生長試驗：基于預實驗研究結果，各處理分別于解除脅迫15 d后取樣測定各項生理生化指標。

1.2.2 測定方法 SPAD值用SPAD-502Plus葉綠素儀測定，選擇幼苗的第2～4片真葉，每處理測定30個數據；用DDS-11A數顯電導率儀測定葉片浸出液的電導率，用相對電導率（RCE）表示膜的受傷害程度；其他指標測定參考《植物生理生化實驗原理和技術》[12]，丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法；可溶性糖（SS）含量測定采用蒽酮比色法；可溶性蛋白（SGS）測定采用考馬斯亮藍G-250染色法；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑法測定；過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法測定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創木酚氧化法測定。測量儀器使用T6新世紀紫外可見分光光度計，每個指標3個重復取其平均值。

高溫脅迫SPAD變化值=高溫處理后各處理SPAD值-預處理后各處理SPAD值。

恢復生長SPAD變化值=恢復生長后各處理SPAD值-預處理后各處理SPAD值。

1.3 數據處理

數據用SPSS 18.1進行差異顯著性分析，采用單因素（one-way ANOVA）和Duncan法（α=0.05）；用Canoco 5.0進行冗余分析（RDA）。

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫及恢復生長下華石斛幼苗的形態特征

隨著溫度升高和脅迫時間延長，華石斛幼苗的受害程度不斷加深。30 ℃和35 ℃處理1 d，幼苗與CK（對照，25 ℃/20 ℃）差別不大；高溫30 ℃和35 ℃ 處理4 d后，幼苗葉片出現萎蔫、發黃、燒尖、褐化和掉落現象；35 ℃處理8 d和40 ℃處理4 d時植株褐化嚴重，莖基部腐爛；40 ℃處理8 d時95%的幼苗整株萎蔫枯死，故該處理下生理生化指標僅能夠測定SPAD值和相對電導率（圖1-A）。

高溫脅迫解除15 d后，30 ℃和35 ℃處理1～2 d的幼苗有分蘗現象；30 ℃和35 ℃處理4～8 d的幼苗葉片萎蔫，燒尖、黃化和褐化現象無法恢復，恢復期持續落葉；40 ℃處理1 d的幼苗葉片萎蔫蜷曲，處理2～4 d的幼苗葉片褐化、掉落，莖基部腐爛；40 ℃處理8 d的幼苗整株褐化枯死（圖1-B）。

2.2 高溫脅迫和恢復生長下華石斛幼苗的生理特征

2.2.1 高溫脅迫下華石斛幼苗的生理特征 隨著脅迫的不斷加深，幼苗葉片的SPAD值呈現出不同程度的下降（圖2-A），脅迫溫度越高、脅迫時間越長，下降速度越快。30、35、40 ℃處理8 d相比預處理時，SPAD分別下降了20.5%、10.5%、59.0%；在25 ℃處理8 d時，SPAD值有上升的趨勢，達到預處理時的108.6%。

相同溫度下隨處理時間的增加，電導率曲線趨勢呈初期較平直，后期為只升不降的半拋物線，脅迫程度越深電導率越大。40 ℃處理2 d時，與對照差異顯著；4 d的所有高溫處理均與對照差異顯著；40 ℃處理8 d時，相對電導率達到所有處理中的最大值76.7%（圖2-B）。

MDA含量與相對電導率趨勢較一致，但在35 ℃處理8 d和40 ℃處理2 d時，MDA含量急劇下降。30、35和40 ℃分別處理8、4和1 d時，MDA含量分別達到其相同溫度各處理中的峰值，分別比對照增加了193.27%、219.97%、202.05%（圖2-C）。

可溶性蛋白（圖2-D）在不同溫度下含量隨時間的變化消長動態有所不同，分別在高溫30 ℃處理4 d、35 ℃處理2 d和40 ℃處理1 d時含量最高，分別比對照增加了55.0%、67.5%和12.6%；高溫脅使可溶性糖（圖2-E）的含量有所增加，高溫處理30、35和40 ℃時其含量分別在脅迫4、2和1 d時達到峰值，分別比對照增加了33.8%、35.9%和40.0%。

高溫脅迫程度較輕時，SOD、POD和CAT酶的活性（圖2-F～H）整體呈增加趨勢，但是隨著脅迫溫度的增加和脅迫時間的延長，三者活性開始出現下降。SOD的活性分別在30 ℃處理2 d、35 ℃處理2 d和40 ℃處理1 d時達到峰值，分別比相應對照增加了227.5%、161.6%和143.3%；POD在30 ℃處理4 d、35 ℃處理1 d和40 ℃處理2 d時達到峰值，分別比相應對照增加了32.0%、75.1%和84.9%；CAT的活性分別在30 ℃處理4 d、35 ℃處理1 d和40 ℃處理1 d時達到峰值，分別比相應對照增加了36.9%、2.4%和23.4%。

2.2.2 恢復生長后華石斛幼苗的生理特征 恢復生長15 d后，高溫脅迫過1 d的幼苗在40 ℃高溫處理的各項生理生化指標均與對照差異顯著；30 ℃處理的各指標與對照差異不大，恢復情況較好。高溫脅迫2 d后再恢復，不同溫度處理下幼苗的MDA含量（圖3-C）和SOD（圖3-F）活性均有向CK靠近的趨勢；40 ℃處理的可溶性糖含量（圖3-E）較高溫處理時有所上升。高溫脅迫4 d后再恢復，30 ℃和35 ℃高溫處理的幼苗MDA含量、相對電導率（圖3-B）有所回落但仍維持在較高水平，與對照差異顯著；40 ℃處理下相對電導率急速升高，甚至超過脅迫時達到67.76%。高溫處理8 d的幼苗恢復生長15 d后，30 ℃和35 ℃處理的SPAD（圖3-A）僅達到預處理時的85.9%、82.6%，此時25 ℃處理的SPAD值則達到了預處理的1.25倍。

2.3 華石斛幼苗生理指標受高溫脅迫的冗余分析（RDA）

處理1～2 d時，高溫對各生理指標即可產生顯著的影響，這一時期，高溫下生長的華石斛幼苗主要表現為對電導率、可溶性糖含量、MDA含量、SOD活性和POD活性相對較高，而SPAD相對較低。此外，可溶性蛋白含量和CAT活性受溫度的影響較小。處理4～8 d后，高溫使華石斛幼苗的相對電導率、MDA含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量等生理指標升高，而SPAD、CAT、SOD和POD活性等生理指標隨溫度增高而降低（圖4）。

3 討論

3.1 高溫脅迫下華石斛幼苗的形態特征

高溫抑制華石斛正常的生理代謝，導致其葉片出現萎蔫、失綠、掉落等外部形態的變化。本試驗中30 ℃和35 ℃持續4 d以上的高溫和40 ℃的極端高溫，引起華石斛葉片萎蔫、褐化和落葉，甚至全株枯死，與其他植物在高溫下的表現相同[13]。推測華石斛幼苗對高溫極為敏感，對持續高溫或極端高溫抵御能力差。

3.2 高溫脅迫對華石斛幼苗生理參數的影響

葉綠素含量是反映植物光合能力和健康狀態的重要指標[14]，本研究中，所有高溫處理下的幼苗SPAD值均有所下降，并且處理溫度愈高、處理時間愈長，SPAD值下降越快，該結果與林曉紅等[15]對蘭科金線蓮（Anoectochilus roxburghii）的研究結果一致，反映高溫造成華石斛葉綠素分解破壞。已有研究表明高溫導致膜透性增加和膜脂質過氧化[16]，華石斛受高溫脅迫后相對電導率持續增加，恢復生長15 d后MDA含量變化不大，這與大多數研究者的結論相同[17]，初步推測華石斛的抗逆性較弱。本研究中，可溶性糖、可溶性蛋白含量和SOD、CAT、POD酶活性受溫度影響，且在脅迫初期（1～2 d）時均與溫度正相關，這符合植物在逆境下的一般反應[18]；持續脅迫時SOD、POD、CAT活性出現下降，這可能是由于不斷加劇的高溫傷害到了酶本身[19]。華石斛幼苗通過協調體內營養物質、滲透調節物質和保護酶活性等的動態平衡，增強抗熱性，從而減輕高溫帶來的傷害[20]，是其對高溫脅迫的適應性反應和耐熱生存的重要調節機制。

3.3 華石斛幼苗耐熱性生理鑒定指標的選擇

脅迫初期，溫度對各種生理指標的影響主要表現在相對電導率、MDA含量、可溶性糖含量、SOD活性等增加，而SPAD減少，CAT活性受溫度影響不大（圖4）；持續脅迫導致相對電導率和MDA含量大幅增加，可溶性糖和可溶性蛋白合成來維持細胞滲透勢，抗氧化酶系統遭到破壞，表現為SOD、POD和CAT活性與溫度呈負相關。這表明高溫對華石斛幼苗的SPAD、CAT有一定的抑制作用，對相對電導率、MDA、可溶性糖和可溶性蛋白含量的增加有一定的誘導作用，且其中SPAD、相對電導率和MDA含量變化明顯，可將其作為華石斛幼苗的耐熱性生理鑒定指標，這與李威等[21]的研究結果一致。

溫度幾乎會影響植物的整個生長發育過程。本研究初步探究了華石斛出瓶組培幼苗在高溫下的形態和生理特征，高溫對華石斛成年植株和野生植株的影響還有待進一步的研究。

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