木霉菌株揮發性物質拮抗尖孢鐮刀菌的效果及其鑒定

張雯雯 國振宇 趙曉迪 龔明波 李世貴 顧金剛 楊禮富

摘 要 采用對扣法研究11株木霉菌株揮發性物質對尖孢鐮刀菌的抑制效果，采用固相微萃取和氣質聯用技術對揮發性物質進行成分分析。結果表明，不同木霉菌株產生的揮發性物質的種類和含量差異較大。11株木霉共檢出257種揮發性物質，均能檢測到六甲基環三硅氧烷、八甲基環四硅氧烷兩種化合物；聚類分析在相關系數距離為19時，可將11株木霉菌株歸為三大類；257種揮發性物質可簡化為3個主成分，包含30種揮發性物質，不同木霉揮發性物質主成分得分與拮抗尖孢鐮刀菌的抑菌率之間極顯著相關，表明11株木霉菌株對尖孢鐮刀菌均有抑制作用。

關鍵詞 木霉；尖孢鐮刀菌；揮發性有機物；抑菌率；主成分分析

中圖分類號 S432.4 文獻標識碼 A

Abstract The inhibitory effects and compounds of volatile substances from 11 Trichoderma strains against Fusarium oxysporum were analyzed. The results showed that there were significant differences between the contents and types of volatile substances of different Trichoderma species. 11 species of Trichoderma were detected 257 kinds of volatile substances， Which can be detected hexamethyl cyclotrisiloxane， octamethyl cyclotetrasiloxane two compounds； When the cluster analysis in the correlation coefficient distance was 19 hours， the 11 Trichoderma could be divided into 3 components. The results showed that ACCC33104 had the highest total score of 30 volatile substances， and the difference of the volatile components of T. viride was different from that of its antagonistic effect on F. oxysporum. The effect of bacteria have a certain relevance. The results showed that Trichoderma had inhibitory effect on F. oxysporum.

Key words Trichoderma； Fusarium oxysporum； volatile organic compounds； antimicrobial rate； principal component analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.019

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是一種世界性分布的土傳病原真菌，寄主范圍廣泛，可引起瓜類、茄科、棉、豆科及花卉等多種植物枯萎病的發生，如香蕉枯萎病就是由古巴尖孢鐮刀菌引起的一種土傳病害[1]。微生物能夠產生多種揮發性的次級代謝產物[2]，且具有分子量低、弱極性、低沸點和親脂性等特點[3-4]，能夠長距離傳播，并介導有機體間非直接接觸的相互作用。木霉菌是一類重要的植物病害生防菌[5]，不同種屬的木霉產生的揮發性物質種類和含量不同，且對病原真菌有不同的抗菌活性[6-7]。Klaus Fiedler[8]等測定哈茨木霉和擬康寧木霉的揮發性物質，發現它們能夠產生乙醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇和3-辛酮等化合物，并且產生的倍半萜類顯示了1個典型的特征圖譜；Tarus[9]等測定了哈茨木霉和長枝木霉的揮發性有機物及其對細菌和蜜環菌的抑制作用，結果表明6-戊基-2H-吡喃-2-酮具有最高的抗真菌和抗菌活性，且在200 ppm時完全抑制蜜環菌的生長；Samantha Lee等[10]檢測了生長5 d和14 d深綠木霉的揮發性物質，發現隨著木霉的生長，有極少的揮發性物質不再能被檢測，而產生了更多的新的揮發性物質，這就說明木霉產生的種類與木霉菌株本身的年齡有關。本研究針對香蕉枯萎病研究11株木霉所產生的揮發性物質對其的拮抗效果，同時對不同種屬的木霉菌株產生的揮發性有機物進行成分分析，以探索木霉揮發性物質的種類和含量及其對尖孢鐮刀菌抑制效果之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

木霉菌株保存在中國農業微生物菌種保藏管理中心和本實驗室： Trichoderma atroviride 5-1P1（菌株編號：ACCC32804）、T. atroviride 16-1M2（菌株編號：ACCC32818）、T. atroviride 70-1M3（菌株編號：ACCC32866）、T. harzianum 71-1P2（菌株編號：ACCC32870）、T. atroviride 193-2P1（菌株編號：ACCC33007）、T. atroviride 222-2M1（菌株編號：ACCC33100）、T. harzianum 223-2M1（菌株編號：ACCC33104）、T. harzianum 226-2P1（菌株編號：ACCC33114）、T. atroviride 231-1M2（菌株編號：ACCC33124）、T. atroviride 247-2P2（菌株編號：ACCC33189）、T. atroviride 258-2M1（菌株編號：ACCC33205）。植物病原菌：香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種FOC4（菌株編號：ACCC38875）作為靶標病原菌，由中國農業微生物菌種保藏管理中心提供，用于木霉揮發性物質對其抑制作用的研究。

1.2 方法

1.2.1 木霉揮發性物質對尖孢鐮刀菌的作用 采用對扣法[11]。用打孔器（d=0.5 cm）在培養5 d的木霉菌菌落邊緣打取菌齡相同的菌塊，接種于PDA平板中央，在其上蓋雙層直徑略大于10 cm的無菌玻璃紙，上方扣一個直徑同為9 cm，中央剛接種尖孢鐮刀菌（d=0.5 cm）的平板，用封口膜密封。以未接種供試木霉的PDA平板與接病原菌的平板對扣培養作為對照，每個處理設3個重復。5 d后用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，計算抑菌率。

抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-0.5）×100%

1.2.2 木霉揮發性物質的分離 將供試菌株接種在PDA培養基上，25 ℃培養7 d，用打孔器（d=0.5 cm）取1塊菌餅接種在二分隔培養皿一側小室的PDA培養基上，用雙層封口膜封住培養皿，25 ℃培養7 d。以不接種木霉的空白PDA平板作為對照。

首先將固相微萃取（SPME）針頭插入氣相色譜儀的進樣口，推出萃取頭，在氦氣流中240 ℃老化20 min，然后將萃取頭縮回保護針管，立即將SPME針頭插入二分隔培養皿未培養木霉的一側小室，推出萃取頭，萃取揮發性物質45 min，再將SPME針頭插入氣相色譜儀的進樣口，推出萃取頭，解吸附30 s，隨后取出SPME進樣手柄和萃取頭。

1.2.3 木霉揮發性物質的鑒定 色譜條件[12]：用HP-5MS型毛細管柱分離揮發性物質，載氣為氮氣，流速為1 mL/min，不分流模式。升溫程序：30 ℃維持2 min，再以5 ℃/min的速率升溫至220 ℃；post run 270 ℃維持1 min。電離電壓為70 eV，離子源溫度230 ℃，質譜掃描速率為3.35 scans/s，質譜范圍20～450 amu。

1.3 數據處理

數據分析與處理采用質譜化學工作站軟件分析（MSD ChemStation G1701DA，安捷倫公司），通過Agilent NIST13數據庫鑒定揮發性物質，扣除對照組檢測到的色譜峰，用峰面積歸一化法測定了這些化學成分在各自樣品中的相對含量。用SPSS 16.0 軟件進行抑菌率的統計分析以及揮發性物質的聚類分析、主成分分析以及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 揮發性物質拮抗效果分析

不同種屬木霉產生的揮發性物質對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制率不同。其中，菌株ACCC33104、ACCC33100、ACCC33007、ACCC33124、ACCC33205這5株菌的抑菌率分別為35.29%、34.02%、33.19%、30.22%、30.17%；菌株ACCC32866、ACCC32818的抑菌率分別為28.77%、28.23%；菌株ACCC33189、ACCC32870、ACCC32804、ACCC33114的抑菌率則分別為23.61%、22.69%、21.88%、20.83%（見圖1）。根據差異顯著性分析，菌株ACCC33104、ACCC33100、ACCC33007，菌株ACCC33124、ACCC33205、ACCC32866、ACCC32818，菌株ACCC33189、ACCC32870、ACCC32804、ACCC33114這三組之間差異并不顯著，其余均存在顯著差異。

2.2 揮發性物質成分分析

通過對GC-MS譜圖的NIST 13譜庫搜索和人工解析，從11株木霉中共鑒定出257種揮發性物質，結果見表1。其中，烷類68種，酯類47種，烯類36種，醇類29種，酮類23種，苯類9種，醚類7種，其他44種，分別占檢出揮發性物質的26.46%、18.29%、14.01%、11.28%、8.95%、3.50%、2.72%和17.12%，就種類的多樣性而言，木霉產生的揮發性物質主要是烷類、酯類，其次是烯類、醇類和酮類；就含量的多樣性而言，木霉產生的揮發性物質主要是醇類。其中，在11株木霉中均能檢測到六甲基環三硅氧烷、八甲基環四硅氧烷兩種化合物，其相對含量范圍分別為0.540 9%～6.111 5%、0.345 2%～4.430 8%。

2.3 揮發性物質聚類分析

從表1可見，不同種屬木霉產生的揮發性物質的種類和含量存在較大差異，甚至同一種屬木霉產生的揮發性物質的種類和含量也不同。由圖2可見，相關系數距離為19時，可以把11株木霉分成三大類，第一類包括ACCC33124、ACCC33205、ACCC33114、ACCC32870、ACCC33189、ACCC32866、ACCC32818；第二類包括ACCC32804；第三類包括ACCC33007、ACCC33104、ACCC33100；聚類結果表明：每一類別中木霉產生的揮發性物質較為接近。進一步分析表明：木霉產生的揮發性物質種類與木霉種屬之間無相關性。

2.4 11株木霉揮發性物質的主成分分析

選取30種物質對11株木霉產生的揮發性物質進行主成分分析，從主成分特征值和貢獻率（表2）可見，前3個主成分的貢獻率分別為43.396%、15.892%、13.615%，累積貢獻率達到72.903%。因此，提取3個主成分，即m=3。從旋轉后的因子載荷矩陣表（表3）可知，3個主成分包含的揮發性物質反映了11株木霉揮發性物質的主要信息。

從表3可知，第1主成分主要反映乙醇、2-甲基-1-丙醇、六甲基-環三硅氧烷、八甲基-環四硅氧烷、十甲基-環戊硅氧烷、十二烷、十三烷、十二甲基-環己硅氧烷、十四烷、2，2，3，5，6，6，7-七甲基[1，4，2，3，5，6，7]二氧雜戊烷、3-羥基丁酮、6-戊基-2H-吡喃-2-酮、1，3-二甲基-苯、丁基化羥基甲苯、苯乙烯、反式 - 香檸檬烯、2-戊基-呋喃、二氧化碳、阿莫地喹等成分的信息；第2主成分主要反映亞硫酸，2-乙基己基十六烷基酯、乙苯、[S-（E，Z，E，E）]-3，7，11-三甲基-14-（1-甲基乙基）-1，3，6，10-環十四碳四烯、（E）-3-十二碳烯、2，2，4，6，6-五甲基-3-庚烯等成分的信息；第3主成分主要反映二甲基-硅烷二醇、3-甲基-1-丁醇、三甲基-十二烷、2，6，10，14-四甲基-十六烷、（R*，R*）-（.+/-.）-1，1-[1，2-雙（1，1-二甲基乙基）-1，2-乙二基]雙-環己烷、β-水芹烯等成分的信息。

第1主成分主要是以烷類為主，第2主成分主要是以烯類為主，第3主成分主要以烷類和醇類為主，這與總成分分析得出的種類多樣性結果基本相符，因此這些主成分具有較強的代表性，可以作為評價木霉產生揮發性物質種類的重要指標。

根據各主成分的貢獻率可以得到主成分綜合評價指數，在本研究中，主成分綜合評價指數F=0.60F1+0.22F2+0.19F3。

11株木霉的揮發性物質的3個主成分得分見表4，可見綜合排名ACCC33104為第一，其次為ACCC33100和ACCC33007。

2.5 相關性分析

將11株木霉揮發性物質的主成分得分與拮抗尖孢鐮刀菌的抑菌率進行相關性分析，結果表明（表5），揮發性物質的主成分得分與抑菌率之間的相關性系數為0.869，對應的顯著性為0.001，表明二者之間的相關性達到極顯著水平。這就說明ACCC33104菌株在拮抗尖孢鐮刀菌和產生揮發性物質上都具有較強的優勢。

3 討論

本文以香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種FOC4為靶標，對木霉菌株所產揮發性物質的抑菌效果以及成分進行分析。研究結果表明，T. atroviride 5-1P1等11株木霉揮發性物質對尖孢鐮刀菌均有明顯的抑制作用。從11株木霉中共鑒定出257種揮發性物質，其中烷類68種，酯類47種，烯類36種，醇類29種，酮類23種，苯類9種，醚類7種，其他44種，多于現有的研究報道[4，13-14]。木霉揮發性物質與拮抗尖孢鐮刀菌的抑菌率顯著相關。不同種屬的木霉在揮發性物質的種類和含量上存在一定差異，這種差異與木霉本身的性質、營養條件以及萃取方法的不同都有一定的關系[13，15]。Wheatley[16]等測定了擬康寧木霉和綠色木霉在兩種不同培養基上的揮發性物質，發現不同的木霉種屬和培養基類型能夠產生不同種類和含量的揮發性物質，這與本研究得到的結果相符。截至目前，盡管大量的木霉產生的揮發性物質已被鑒定，但僅少數揮發性物質的功能被證實。6-戊基-2H-吡喃-2-酮，具有特征的甜椰子狀香味的聚酮化合物，其主要生物學功能包括減少霉菌毒素的產生[17-18]、抗真菌活性[19]以及促進生長等[20]，本研究中能夠產生該物質的木霉有6株，含量從0.79%～19.6%，該物質在康寧和哈茨木霉中均有報道，但本研究中有4株深綠木霉中首次被檢出。通過深入研究，有望揭示木霉揮發性物質拮抗尖孢鐮刀菌的作用機制，為研發由尖孢鐮刀菌引起的作物土傳病害生物防治技術奠定理論基礎。

參考文獻

[1] 黎永堅， 于 莉. 香蕉枯萎病發病機制及其防治技術研究[J]. 中國農學通報， 2006， 22（8）： 515-519.

[2] Daniela Minerdi， Simone Bossi， Maria Lodovica Gullino， et al. Volatile organic compounds： a potential direct long-distance mechanism for antagonistic action of Fusarium oxysporum strain MSA 35[J]. Environmental Microbiology， 2009， 11（4）： 844-854.

[3] Richard Hung， Samantha Lee， Joan W Bennett. Arabidopsis thaliana as a model system for testing the effect of Trichoderma volatile organic compounds[J]. Fungal Ecology， 2013， 6： 19-26.

[4] Morath S U， Hung R， Bennett J W. Fungal volatile organic compounds： a review with emphasis on their biotechnological potential[J]. Fungal Biology Reviews， 2012， 26： 73-83.

[5] Druzhinina I S， Seidl-Seiboth V， Herrera-Estrella A， et al. Trichoderma： the genomics of opportunistic success[J]. Nature Reviews Microbiology， 2011， 9： 749-759.

[6] Wilkins K， Larsen K， Simkus M. Volatile metabolites from mold growth on building materials and synthetic media[J]. Chemosphere， 2000， 41： 437-446.

[7] Bruce A， Verrall S， Hackett C A， et al. Identification of volatile organic compounds （VOCs） from bacteria and yeast causing growth inhibition of sapstain fungi[J]. Holzforschung， 2004， 58： 193-198.

[8] Fiedler K， Schütz E， Geh S. Detection of microbial volatile organic compounds（MVOCs） produced by moulds on various materials[J]. International Journal of Hygiene and Environmental Health， 2001， 204： 111-121.

[9] Tarus P K， Langat-Thoruwa C C， Wanyonyi A W， et al. Bioactive metabolites from Trichoderma harzianum and Trichoderma longibrachiatum[J]. Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia， 2003， 17： 185-190.

[10] Lee S， Hung R， Yap M， et al. Age matters： the effects of volatile organic compounds emitted by Trichoderma atroviride on plant growth[J]. Archives of Microbiology， 2015， 197： 723-727.

[11] Muthukumar A， Eswaran A， Sanjeevkumas K. Exploitation of Trichoderma species on the growth of Pythium Aphanidermatum in chilli[J]. Brazilian Journal of Microbiology， 2011， 42： 1 598 -1 607.

[12] Hexon Angel Contreras-Cornejo， Lourdes Macías-Rodríguez， Alfredo Herrera-Estrella， et al. The 4-phosphopantetheinyl transferase of Trichoderma virens plays a role in plant protection against Botrytis cinerea through volatile organic compound emission[J]. Plant and Soil， 2014， 379： 261-274.

[13] Norbert Stoppacher， Bernhard Kluger， Susanne Zeilinger， et al. Identification and profiling of volatile metabolites of the biocontrol fungus Trichoderma atroviride by HS-SPME-GC-MS[J]. Journal of Microbiological Methods， 2010， 81： 187-193.

[14] Henryk Jele， Lidia Bl/ aszczyk， Jerzy Chel/ kowski， et al. Formation of 6-n-pentyl-2H-pyran-2-one （6-PAP） and other volatiles by different Trichoderma species[J]. Mycological Progress， 2014， 13： 589-600.

[15] Nemcvovicv M， Jakubíková L， Víden I， et al. Induction of conidiation by endogenousvolatile compounds in Trichoderma spp.[J]. FEMS Microbiology Letters， 2008， 284： 231-236.

[16] Wheatley R， Hackett C， Bruce A， et al. Effect of substrate composition on the production of volatile organic compounds from Trichoderma spp. inhibitory to wood decay fungi[J]. International Biodeterioration and Biodegradation， 1997， 39（2-3）： 199-205.

[17] Horace G Cutler， Richard H Cox， Farrist G Crumley， et al. 6-Pentyl-α-pyrone from Trichoderma harzianum： Its plant growth inhibitory and antimicrobial properties[J]. Agricultural and Biological Chemistry， 1986， 50： 2 943-2 945.

[18] Cooney J M， Lauren D R， Di Menna M E. Impact of competitive fungi on trichothecene production by Fusarium graminearum[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2001， 49： 522-526.

[19] Scarselletti R， Faull J L. In vitro activity of 6-pentyl-α-pyrone， a metabolite of Trichoderma harzianum， in the inhibition of Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici[J]. Mycological Research， 1994， 98： 1 207-1 209.

[20] Vinale F， Sivasithamparam K， Ghisalberti E L， et al. A novel role for Trichoderma secondary metabolites in the interactions with plants[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology， 2008， 72： 80-86.