雞新城疫病毒和禽肺炎病毒二重RT—PCR檢測方法的建立及應用

謝志勤 謝芝勛 鄧顯文 謝麗基 范晴 羅思思 黃莉 黃嬌玲 張艷芳 王盛 劉加波 龐耀珊 梁亮 馮務玲

摘要：【目的】建立一次性可同時擴增鑒別雞新城疫病毒（NDV）和禽肺炎病毒（APV）的二重RT-PCR，為有效防控雞新城疫和禽肺炎病毒病提供技術支持?！痉椒ā扛鶕礼enBank已發表NDV的F基因序列（GenBank登錄號JX840454）和APV的F基因序列（GeneBank登錄號AF187154）分別設計2對特異性引物，應用這2對引物建立可同時檢測鑒別NDV和APV的二重RT-PCR，對擴增條件進行優化，并通過特異性試驗、敏感性試驗和臨床樣品檢測等驗證其實用性?！窘Y果】優化后的二重RT-PCR可特異性擴增出參試NDV毒株（LaSota株、F48E9株、I株）及APV/MN-10毒株的目的條帶，其大小分別為247和424 bp，而其他對照參試毒株在247和424 bp處均無特異條帶出現。二重RT-PCR針對NDV和APV的最低檢出限均為10 pg的RNA。應用建立的二重RT-PCR對132份從廣西采集的病雞樣品進行檢測，結果得到NDV陽性樣品26份、APV陽性樣品2份，與血清學方法的鑒定結果一致。隨機選取的2份NDV陽性PCR產物與NDV（GenBank登錄號JX840454）的F基因序列一致，同源性達100%；2份APV陽性PCR產物與APV（GenBank登錄號AF187154）的F基因序列也完全一致，同源性達100%。【結論】針對NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特異性好、靈敏度高、簡便快速的特點，可用于臨床快速鑒別診斷，為有效防控雞新城疫和禽肺炎病毒病提供了技術支持。

關鍵詞： 雞新城疫病毒（NDV）；禽肺炎病毒（APV）；二重RT-PCR；檢測

中圖分類號： S858.31 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）03-0546-06

0 引言

【研究意義】雞新城疫病毒（Newcaslte disease virus，NDV）和禽肺炎病毒（Avian pneumovirus，APV）是危害養雞業的兩種主要病毒，二者均為副粘病毒科（Paramyxoviridae）成員，其中，NDV隸屬于副粘病毒屬（Paramyxovirus），而APV隸屬于禽偏肺炎病毒屬（Avian pneumovira）（Pringle，1998）。NDV全基因長15198 bp，基因組為不分節段的單股負鏈RNA，共編碼6個基因蛋白，依次為核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素—神經氨酸酶（HN）和大蛋白（L）（Huang et al.，2004）。APV全基因長約14000 bp，為負鏈RNA，基因中有8種編碼蛋白，依次為核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質蛋白（M）、融合蛋白（F）、第二基質蛋白（M2）、小疏水蛋白（SH）、糖蛋白（G）和聚合酶蛋白（L）（Naylor et al.，2004；胡海霞等，2012）。這兩種病毒引起的臨床癥狀很相似，均可引起禽類上呼吸道的癥狀，因此根據臨床癥狀很難對二者進行鑒別，需通過實驗室檢測手段進行確診。【前人研究進展】我國對NDV的研究非常重視，建立了很多檢測診斷方法，如傳統的病毒分離鑒定（陳安莉等，2012）和血清學方法等，近年又出現了高通量GeXP檢測方法（羅思思等，2013）。這些方法為準確檢測診斷NDV提供了技術保障，是有效防控雞新城疫發生的前提。針對APV的診斷國外已開展了相關研究，我國起步相對較晚，其診斷方法主要有病毒分離鑒定（Goyal et al.，2000；Cook and Cavanagh，2002）、ELISA（Gulati et al.，2000；Goyal et al.，2003）、RT-PCR（Shin et al.，2000；陳琳等，2012）、Taqman探針熒光定量PCR（謝志勤等，2014a）等。雖然目前實驗室診斷NDV和APV的方法都已成熟，但缺少針對兩種病混合感染的快速鑒別診斷，不利于養雞業的健康發展。二重（或多重）PCR是利用兩對（或多對）引物同時擴增兩個（或多個）模板，能有效彌補常規PCR的不足（范志宇等，2015；秦毅斌等，2016），在禽類疫病鑒別診斷中得到廣泛應用，如吳萍萍等（2010）建立了雞傳染性貧血病毒和禽網狀內皮增生癥病毒二重PCR檢測方法，謝麗基等（2012）建立了鴨I型肝炎病毒、鴨圓環病毒和番鴨細小病毒三重RT-PCR檢測方法，謝志勤等（2016）建立了H9亞型禽流感病毒和APV二重RT-PCR檢測方法，奉彬等（2016）建立了雞細小病毒和禽呼腸病毒二重PCR檢測方法?！颈狙芯壳腥朦c】根據現代養雞業快速發展及防病的需求，尤其針對臨床癥狀相似且難以進行診斷的雞病，應建立快速鑒別的診斷方法，但至今尚無針對NDV和APV二重RT-PCR檢測方法的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】通過在NDV和APV兩種病毒各自F基因保守區域設計2對特異引物，建立一次性可同時擴增鑒別二者的二重RT-PCR，為有效防控雞新城疫和禽肺炎病毒病提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

NDV標準毒株（LaSota株、F48E9株、I株）、禽呼腸孤病毒（Reo S1133）和禽大腸桿菌（E. coli O2）購自中國獸醫藥品監察所，NDV分離株（GX/2010和GX/2013）由廣西動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室分離鑒定并保存提供，APV（MN-10毒株）由美國濱夕法尼亞大學Lu教授惠贈，雞馬立克氏病毒（MDV）疫苗毒購自南京梅里亞動物保健品公司，禽流感病毒H9（AIV H9）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV Mass 41）、雞傳染性喉氣管炎病毒（北京株，ILTV）、禽腦脊髓炎病毒（AEV Van）和雞毒霉形體（MG S6）均由廣西動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室保存提供。SPF雞胚（7～10日齡）是從北京梅里亞種禽有限公司購進SPF種蛋自行孵化獲得。反轉錄酶AMV、RNA抑制劑、dNTPs、隨機引物和2×Premix TaqTM Mix等購自寶生物工程（大連）有限公司，小量質粒提取試劑盒和膠回收純化試劑盒購自美國Omega公司，其他試劑為進口或國產分析純。

1. 2 引物設計與合成

根據GenBank已發表NDV的F基因序列（GenBank登錄號JX840454）和APV的F基因序列（GenBank登錄號AF187154），通過DNASTAR MegAlign對其序列進行比對分析，找出各自F基因的保守序列區間，應用PrimerSelect設計2對特異性引物（表1）。引物序列由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1. 3 病毒增殖及處理

1. 3. 1 NDV增殖及處理 NDV標準毒株（LaSota株、F48E9株、I株）用滅菌PBS按1∶1000進行稀釋，然后經雞胚尿囊腔分別接種10日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，收集24～120 h死亡雞胚尿囊液。雞胚尿囊液經8000 r/min離心5 min，收集上清液用于RNA提取或-70 ℃保存備用。

1. 3. 2 APV增殖及處理 參照謝志勤等（2014b）的增殖方法進行操作。

1. 4 樣品處理及RNA提取

取病雞的肺臟、氣管和脾臟等組織，按1∶5加入滅菌PBS進行研磨，研磨后的懸液分裝于1.5 mL離心管中，-70 ℃下反復凍融3次（4 h內），8000 r/min離心5 min，收集上清液用于病毒增殖。病毒增殖后按Xie等（2005）的方法進行總RNA提取，提取的總RNA直接用于反轉錄（RT）或-20 ℃保存備用。

1. 5 RT-PCR擴增條件優化

對RT-PCR反應體系所用的Buffer、dNTPs、Mg2+、Random 9-mer（自由引物）、反轉錄酶AMV、RNA 抑制劑、RNA模板濃度、Taq DNA聚合酶及擴增程序的退火溫度等進行優化，篩選出最佳的反應濃度及擴增條件。

1. 6 特異性及敏感性試驗

以NDV標準毒株（LaSota株、F48E9株、I株）、APV/ MN-10毒株及AIV H9毒株、IBV Mass 41毒株、ILTV（Beijing）毒株、AEV Van毒株、MG S6毒株、Reo S1133毒株、E. coli O2菌株和MDV毒株的RNA或DNA為模板，進行RT-PCR或PCR擴增，檢測二重RT-PCR的特異性。同時，測定NDV LaSota毒株和APV/MN-10毒株的RNA濃度，然后進行10倍梯度稀釋，取100 ng～100 fg共7個稀釋度的RNA（2.0 μL）為模板進行敏感性檢測試驗。

1. 7 臨床樣品檢測

提取132份來自廣西不同地區養雞場病雞肺臟、氣管和脾臟樣品的RNA，應用建立的二重RT-PCR對提取的樣品RNA進行檢測。同時，取相同樣品研磨后以0.2 μm濾膜無菌過濾進行病毒分離，經卵黃囊接種7日齡SPF雞胚或經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，以評價二重RT-PCR對臨床樣品檢測的實用性。

1. 8 序列分析比對驗證

隨機選取NDV和APV各2份PCR檢測陽性樣品產物進行序列測定比對，將回收純化的PCR陽性產物與pMD18-T進行連接，然后轉染大腸桿菌DH5α（TaKaRa公司）。提取轉染質粒的DNA，經雙酶切和PCR鑒定，陽性克隆送至寶生物工程（大連）有限公司測序，并采用DNASTAR對測序結果進行比對分析。

2 結果與分析

2. 1 二重RT-PCR產物檢測結果

將12.0 μL二重RT-PCR產物（含2.0 μL加樣緩沖液）加入預先用TBE（Tris 5.40 g，硼酸2.75 g，0.5 mol/L EDTA 2.0 mL）制備的1.5%瓊脂糖凝膠孔中，以80 V/cm電壓進行凝膠電泳，經Gelred染色后在紫外線下觀察拍照，結果（圖1）顯示，NDV毒株樣品約在240 bp處出現明亮條帶，APV毒株樣品約在420 bp處出現明亮條帶，與預期結果一致。

2. 2 二重RT-PCR擴增條件優化

對二重RT-PCR反應體系各成分配比進行優化篩選，獲得最佳的配比條件為：（1）反轉錄（RT）體系10.0 μL，即5×RT Buffer（含10 μmol/L dNTPs、Mg2+）2.0 μL，50 μmol/L Random 9-mer（自由引物）0.5 μL，反轉錄酶AMV 0.5 μL，RNA抑制劑0.5 μL，NDV LaSota毒株和APV/MN-10毒株的RNA模板各2.0 μL，滅菌的無RNA水2.5 μL。（2）PCR反應體系25.00 μL，即2×Premix TaqTM Mix12.50 μL（含10 μmol/L dNTPs、Mg2+、5 U Ex Taq DNA酶），RT產物2.00 μL，50 pmol/μL的APVF/APVR各0.25 μL，50 pmol/μL的NDVF/NDVR各0.25 μL，滅菌超純水9.50 μL。同時，對不同退火溫度（51、53、55、57、59和61 ℃）進行優化，確定最佳反轉錄程序：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min；最佳PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃1 min，進行35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃結束反應。

2. 3 特異性及敏感性試驗結果

參試的NDV LaSota毒株、F48E9毒株和I毒株均擴增出247 bp的特異性條帶，APV/MN-10毒株擴增出424 bp的特異性條帶，而AIV H9毒株、IBV Mass 41毒株、ILTV毒株、AEV Van毒株、MG S6毒株、Reo S1133毒株、E. coli O2菌株和MDV毒株在247和424 bp處均無特異條帶出現（圖1）。以10倍梯度稀釋NDV LaSota毒株和APV/MN-10毒株的RNA為模板進行敏感性試驗，結果發現二重RT-PCR最低能檢測到10 pg的對應RNA模板（圖2）。

2. 4 臨床樣品檢測結果

對132份病雞樣品的RNA進行二重RT-PCR檢測，結果顯示有26份樣品呈NDV陽性，2份樣品呈APV陽性（圖3），其中1份樣品為NDV和APV混合感染，其余的104份樣品均未檢測出NDV或APV的特異條帶。樣品病毒分離后經血清學方法鑒定，發現有NDV陽性26份、APV陽性2份，與二重RT-PCR檢測結果一致。

2. 5 序列分析結果

隨機選取NDV和APV各2份PCR檢測陽性產物進行序列測定，利用DNASTAR進行比對分析，結果表明，2份NDV陽性PCR產物與NDV（GenBank登錄號JX840454）的F基因序列一致，同源性達100%；2份APV陽性PCR產物與APV（GenBank登錄號AF187154）的F基因序列也完全一致，同源性達100%。

3 討論

疫病防控一直是現代養雞業的首要任務。除禽流感外，雞新城疫也是一種必須防控的傳染病，雖然我國對雞新城疫已采取各種預防措施，但每年因該病引起的損失仍然十分巨大。相對于禽流感、雞新城疫病等重大疫病，APV引起的疾病尚未引起人們足夠重視。APV的最早報道是引起火雞呼吸道疾病，隨后在歐洲流行，死亡率高達25%～40%（Cook et al.，2000）。我國最早報道該病是在1998年（沈瑞忠等，1999），郭龍宗和曲立新（2009）進行血清學調查，發現我國雞群中APV感染很普遍，感染率高的地區可達100%。APV和NDV引起的臨床癥狀很相似，主要表現為上呼吸道癥狀，尤以噴嚏、眼結膜潮紅、淚腺腫、產蛋下降、孵化率低及神經癥狀為主。因此，根據臨床癥狀很難對二者進行鑒別，需通過實驗室檢測手段進行確診，但目前尚無可同時檢測鑒別APV和NDV的方法。

NDV和APV的融合蛋白（F）是非常重要的結構蛋白，其功能是參與細胞的吸附過程。雖然二者的融合蛋白（F）功能相同，但其蛋白序列結構并不一致，具有種屬特異性，因此該蛋白常被用于檢測鑒別病毒特征。本研究利用各自融合蛋白（F）的種屬特異性，在其基因保守序列區域分別設計擴增NDV和APV的2對特異性引物，建立了一次擴增鑒別二者的二重RT-PCR檢測方法。特異性試驗結果表明，參試的NDV LaSota毒株、F48E9毒株和I毒株均能擴增出247 bp的特異性條帶，APV/MN-10毒株擴增出424 bp的特異性條帶，而對照的AIV H9毒株、IBV Mass 41毒株、ILTV毒株、AEV Van毒株、MG S6毒株、Reo S1133毒株、E. coli O2菌株和MDV毒株在247和424 bp處均無特異條帶出現，說明本研究建立的NDV和APV二重RT-PCR具有特異性，其最低檢出限均為10 pg的RNA，表明其具有良好的敏感性。

為進一步驗證本研究建立的二重RT-PCR，采用該方法對臨床樣品進行檢測，結果發現有NDV陽性26份，陽性檢測率19.69%（26/132），APV陽性2份，陽性檢測率1.51%（2/132）。此外，通過對2份NDV陽性樣品和2份APV陽性樣品進行序列測定比對，證實所擴增的各自F基因序列片段正確，說明建立的二重RT-PCR具有很高的實用性，可用于臨床檢測，為快速鑒別檢測NDV、APV及有效防控雞新城疫和禽肺炎病毒病提供技術支持。

4 結論

針對NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特異性好、靈敏度高、簡便快速的特點，可用于臨床快速鑒別診斷，為有效防控雞新城疫和禽肺炎病毒病提供了技術支持。

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（責任編輯 蘭宗寶）