頂空—氣相色譜法測定動物源制品中三甲胺含量的測量不確定度評定

應月 劉超曄 孫杰

摘要[目的]分析頂空-氣相色譜法（HS-GC）測定動物源制品中三甲胺含量的測量不確定度來源并定量。 [方法]建立（HS-GC）測定動物源制品中三甲胺含量的測量不確定度評定的數(shù)學模型，從測定程序各步驟評定不確定度的各項來源，對該方法所得結(jié)果的已識別來源的不確定度影響進行評價。[結(jié)果]該方法測定動物源制品中三甲胺含量的不確定度主要來源于三甲胺鹽酸鹽標準溶液及樣品處理過程。當動物源制品中三甲胺含量為9.20 mg/kg時，其擴展不確定度為0.56 mg/kg（K=2，P=95%）。[結(jié)論]該評定方法在實際工作中對提高三甲胺檢測數(shù)據(jù)的可靠性與準確性具有一定指導意義。

關(guān)鍵詞動物源制品； 三甲胺；頂空氣相色譜法；不確定度

中圖分類號S851.34+7文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）20-0089-02

Abstract[Objective] A mathematical model was established to assess the uncertainty in determination of trimethylamine in animal derived food by headspace gas chromatography.[Method] Various sources of uncertainty for measurement results during the analysis have been evaluated and the identified key factors were assessed.In this paper，the impacts of major source of measurement uncertainty were methanol standard solution and sample preparation.[Result]The uncertainty of trimethylamine in animal derived food determined by HSGC originated mainly from trimethylamine standard liquid and sample treatment.When the trimethylamine content in animal derived food was 9.20 mg/kg，the expanded uncertainty of measurement results was 0.56 mg/kg（K=2，P=95%）.[Conclusion] This uncertainty evaluation method shows certain guiding significance to improve the reliability and the accuracy of trimethylamine detection in practical work.

Key wordsAnimal derived food；Trimethylamine；Headspace gas chromatography；Uncertainty

人類食用的魚、蝦、豬等肉產(chǎn)品隨著新鮮程度下降，在微生物和酶的作用下不斷降解生成三甲胺[1-2]。從食物中獲取的三甲胺可在肝臟中轉(zhuǎn)化成氧化三甲胺，有研究證明，人體內(nèi)過量氧化三甲胺可促使人體動脈粥樣硬化，導致心血管病發(fā)病[3-4]。因此，檢測動物源制品中三甲胺含量對判斷其新鮮程度、提高其食用安全、保障消費者身體健康意義重大[4-6]。

在檢驗分析工作中，不確定度是測定結(jié)果質(zhì)量的衡量尺度。此前我國三甲胺檢測采用GB/T 5009.179—2003 《火腿中三甲胺氮的測定》，該標準采用分光光度法測定與苦味酸作用形成的苦味酸三甲胺鹽，但是苦味酸可與樣品中其他胺類物質(zhì)反應，故而使測定結(jié)果偏高，此標準已于2017年3月1日廢止[7]。筆者結(jié)合GB 5009.179—2016《食品安全國家標準 食品中三甲胺的測定》（第二法頂空-氣相色譜法）[8]中的檢測方法進行試驗操作，按照JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[9]建立三甲胺的頂空-氣相色譜法（HS-GC）檢測結(jié)果數(shù)學模型，分析檢測過程中的不確定度來源并定量。該不確定度評定結(jié)果可為規(guī)范動物源制品中三甲胺測定步驟、提高測定精密度和準確性提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要儀器和試劑7890氣相色譜儀帶7697A頂空，配氫火焰離子化檢測器（FID），安捷倫公司；三甲胺鹽酸鹽標準品，美國Chem service；其他試劑三氯乙酸、氫氧化鈉均為分析純。

1.2三甲胺標準溶液制備三甲胺標準儲備液：稱取三甲胺鹽酸鹽標準品0.016 2 g，用5%三氯乙酸溶液溶解并定容至100 mL，等同濃度為100 μg/mL的三甲胺標準儲備液，4 ℃保存。分別精密移取三甲胺標準儲備液1、2、5、10至100 mL容量瓶，10、20 mL至50 mL容量瓶，用5%三氯乙酸定容，得到濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL的標準工作溶液。

1.3方法采用GB 5009.179—2016《食品安全國家標準 食品中三甲胺的測定》中“第二法”規(guī)定的方法，稱取約10 g制備好的樣品于50 mL的塑料離心管中，加入20 mL 5%三氯乙酸溶液，用均質(zhì)機均質(zhì)1 min，以4 000 r/min離心5 min，上清液濾入50 mL容量瓶，殘留物再分別用15和10 mL 5%三氯乙酸溶液重復上述提取過程2次，合并濾液并用5%三氯乙酸溶液定容至50 mL。

分別準確吸取樣品提取液、三甲胺標準工作液各2.0 mL于20 mL頂空瓶中，壓蓋密封，用醫(yī)用塑料注射器準確注入5.0 mL 50%氫氧化鈉溶液，備用。制備好的試樣在40 ℃平衡40 min，供HS-GC測定。以保留時間定性，外標法采用峰面積定量。

1.4HS-GC條件石英毛細管色譜柱：聚乙二醇（30.00 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫箱：40 ℃保持3 min，以20 ℃/min速率升至220 ℃，保持1 min；載氣：氮氣（純度99.999%），流速為1.0 mL/min；進樣口溫度220 ℃；自動進樣，進樣量1.0 μL；分流進樣，分流比2∶1。

1.5數(shù)學模型建立試樣中三甲胺含量的測定模型如下：

X=c×Vm

式中，X為試樣中三甲胺含量 （mg/kg）；c為從校準曲線得到的三甲胺濃度 （mg/mL）；V為試樣溶液定容體積 （mL）；m為試樣質(zhì)量（g）。

三甲胺含量X的相對標準不確定度用urel（x）表示，試樣溶液定容體積的相對標準不確定度用urel（V）表示，試樣質(zhì)量m的相對標準不確定度用urel（m）表示，總重復性帶來的相對標準不確定度用urel（）表示。其中c引起的相對不確定度urel（c）主要由標準曲線回歸帶來的相對標準不確定度u曲rel和標準品溶液帶來的相對標準不確定度urel（c0）引起。

由此得到的相對標準不確定度傳播率為：

urel（x）=urel（c）2+urel（V）2+urel（m）2+urel（）2

2不確定度評定

2.1標準溶液引入的不確定度

2.1.1標準物質(zhì)引入的不確定度。由標準物質(zhì)證書可知，三甲胺鹽酸鹽的不確定度為0.5%，按正態(tài)分布k=3，其相對不確定度為up1rel =0.5%3 =1.67×10-3。

2.1.2標準工作溶液配制過程引入的不確定度。

2.1.2.1標準品稱量引起的不確定度。用精度為0.01 mg天平準確稱取三甲胺鹽酸鹽標準品0.016 2 g，服從均勻分布k=3。忽略稱量重復性引入的不確定度。標準品稱量的相對標準不確定度為up2rel=0.0116.2×3=3.56×10-4。

2.1.2.2玻璃儀器校準引入的不確定度。標準工作液配制過程需要使用一系列玻璃量器，按均勻分布屬A類，取k=3[10]，結(jié)果見表1。

按照標準工作液配制過程，由表1數(shù)據(jù)合成的相對不確定度為

up3rel=

u27+

u21+u26+u21+u25+u21+u24+u21+u24+u22+u23+u22=5.71×10-3。

2.1.2.3溫度引起的不確定度。試驗所用玻璃量器在20 ℃校準，實驗室檢測溫度約為25 ℃。20 ℃時水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，玻璃的膨脹系數(shù)為1.5×10-5/℃，在置信概率下的正態(tài)分布取k=2，則uTrel=（σ水-σ玻）×（Tt-T20）×12=4.88×10-4。得到標準品溶液帶來的相對標準不確定度為urel（c0）=u2p1rel+

u2p2rel+u2p3rel+u2Trel=1.67×10-2。

2.1.3標準曲線引入的不確定度。按照“1.2”配制標準工作液，濃度及相應的峰面積見表2。采用最小二乘法擬合得到標準曲線的回歸方程：y=131.357 7x-53.136 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。同一樣品，重復測定6次，得到三甲胺平均含量為1.84 μg/mL。

由標準曲線引入的標準不確定度按下式計算[11]：urel曲=sa1p+1n+（c-）2sXX=1.88×10-2。式中，s為殘差標準偏差，s=nj=1[Aj-（b+a×cj）]n-2=3.16；p為樣品測定次數(shù)，p=6；n為校準的次數(shù)，n=3；c為樣品通過曲線求得的濃度（μg/mL）；為標準曲線6個濃度的平均值（μg/mL）；sxx為離均差平方和，sxx=nj=1（cj-）2=1 116。得出標準曲線查得三甲胺濃度的不確定度為urel（c）=u2rel曲+u2rel（c0）=2.52×10-2。

2.2樣品引入的不確定度

2.2.1樣品取樣的不確定度。該試驗檢測過程中將樣品經(jīng)充分混勻后稱量，認為樣品具有較好的均勻性，代表性充分，忽略取樣所致的不確定度[12]。

2.2.2樣品稱量引入的不確定度。用精度為0.01 mg的天平準確稱取10 g樣品，按均勻分布計算，k=3。天平讀數(shù)穩(wěn)定，忽略稱量重復性引入的不確定度。樣品稱量的相對標準不確定度為：urel（m）=0.0110×1 000×3=5.77×10-7。

2.2.3樣品定容體積引入的不確定度。試驗用50 mL容量瓶，按均勻分布評定，uv1rel=0.0550×3=5.77×10-4。實驗室檢測溫度為25 ℃。在置信概率下的正態(tài)分布取k=2，則uTrel=4.88×10-4。urel（v）=u2v1rel+u2Trel =7.55×10-4。

2.2.4樣品處理步驟引入的不確定度。樣品制備過程引入的不確定度，以2.0 μg/ml為三甲胺質(zhì)量濃度，進行6次空白

樣品添加回收率試驗，回收率結(jié)果分別為86.17%、92.35%、88.22%、84.53%、90.97%、93.26%，平均回收率f回為89.25%，標準偏差s=3.50，urel（）=3n×1回=1.60×10-2，式中n=6。

2.3計算合成不確定度該試驗得出HS-GC測定肉制品中三甲胺含量的合成標準不確定度為urel（x）=

u2rel（c）+u2rel（v）+u2rel（m）+u2rel（）=3.02×10-2。

2.4擴展不確定度及結(jié)果

取擴展因子K=2，在95%置信水平下，相對擴展不確定度為Urel（x）=Kurel（x）= 6.04×10-2。試驗數(shù)據(jù)中，樣品三甲胺含量為9.20 mg/kg，則其擴展不確定度為U=0.56 mg/kg，三甲胺的測定結(jié)果為（9.20±0.56）mg/kg。

3討論

通過對不確定度的計算評定，了解試驗過程中不確定度的來源，并進行分析和量化，從而判斷出可對哪些不確定度分量采取措施，以降低總不確定度。該試驗中，HS-GC測定肉產(chǎn)品中三甲胺含量，測定結(jié)果為（9.20±0.56）mg/kg（K=2，P=95%）。通過比較，發(fā)現(xiàn)三甲胺標準溶液引入的不確定度和樣品處理步驟引入的不確定度對測定結(jié)果不確定度的貢獻較大，樣品稱量與定容對三甲胺測定結(jié)果影響較小。在今后實際檢測工作中，應盡可能規(guī)范試驗操作，提高檢測結(jié)果的準確性。

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