木薯種子體細胞胚誘導發生及植株再生體系建立

韋祖生　楊秀娟　付海天　田益農

摘要：【目的】建立木薯雜交種子誘導體細胞胚發生及植株再生體系，為木薯育種及種質創新提供技術參考?！痉椒ā恳圆煌墒於鹊哪臼砣A南5號（SC5）雜交種子組織為外植體材料，包括未成熟種子子葉（a1）和胚芽（b1）、成熟種子子葉（a2）和胚芽（b2）及誘導萌發種子子葉（a3）、胚芽（b3）和胚軸（c3），利用不同外源激素誘導其體細胞胚胎發生、子葉器官形成、不定芽（莖葉器官）發生和生根，并比較不同外源激素的誘導效果。【結果】利用基本培養基（M1）預培養外植體材料可有效控制其污染率（<5.00%），保持其生物活性（>90.00%），預培養材料的褐化率比對照（未預培養，CK）降低30.00%～40.00%，且預培養的子葉（a）、胚芽（b）和胚軸（c）膨大率分別比cK提高6.67%～13.33%、6.67%～50.00%和20.00%。利用4.00 mg/L 2，4-D和12.00 mg/L Picloram誘導體細胞胚胎發生，結果發現胚芽出胚率較高，胚軸次之，子葉較低；成熟度高的種子材料出胚率高于成熟度低的種子材料；4.00 mg/L 2，4-D誘導的體細胞胚胎發生效果優于12.00 mg/L Picloram。0.10 mg/L BAP和1.00 mg/L NAA均可誘導體細胞胚胎分化、增殖，但0.05 mg/L BAP+0.50 mg/L NAA誘導下a、b和c體細胞胚胎增殖率均比單獨添加0.10 mg/L BAP或1.00 mg/L NAA顯著提高（P<0.05，下同）。a2、a3、b1、b2、b3和c3的不定芽發生率分別為30.00%、40.00%、40.00%、53.33%、70.00%和13.33%，即對于同一組織，成熟度高的種子材料體細胞誘導不定芽發生效果優于成熟度低的種子材料，且不同成熟度的種子均以b最優。a2、a3、b1、b2、b3和c3的生根率分別為23.33%、23.33%、16.67%、30.00%、56.67%0，其中b3的生根率顯著高于其他材料，a2、a3、b1和b2的生根率無顯著差異，也表現為成熟度高的種子材料比成熟度低的種子材料更易誘導生根，發育更好。7種不同成熟度的雜交種子材料組織中，a2、a3、b1、b2和b3經體細胞誘導獲得再生植株，成功率為71.43%?！窘Y論】通過預培養可有效防止木薯雜交種子組織褐化，提高其膨大誘導效果。在木薯生產中，應在培養基中添加4.00 mg/L2，4-D進行體細胞胚胎發生誘導，混合添加0.05 mg/L BAP和0.50 mg/L NAA進行體細胞胚胎增殖培養，且應選擇成熟度高的種子材料（如萌發種子胚芽等）作為外植體材料。

關鍵詞：木薯；種子；體細胞；誘導；再生

中圖分類號：S533.035.3 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）12-2129-07

0引言

【研究意義】木薯（Manihot esculenta Crantz）為大戟科木薯屬植物，是全球重要的糧食作物和經濟作物，也是我國工業發展中淀粉原材料的主要來源。在自然條件下，木薯可異花授粉形成蒴果，產生雜交種子，因此有性雜交是木薯育種最常規、最有效的方法。近年來，國際熱帶農業研究中心（CIAT）通過優化木薯雜交后代的田間選育程序縮短新品種選育周期（Ceballos et al.，2012），但木薯是基因高度雜合的群體，在雜交育種工作過程中常遇到種子胚敗育、種子成熟度低、數量少等技術難題。因此，開展木薯雜交種子體細胞胚胎誘導發生及其植株再生研究，離體培養雜交種子幼胚體，誘導體細胞發生（分化、增殖）、莖葉器官形成及生根，最終發育成新植株，不僅能提高雜交種子的成株率，打破育種瓶頸，還獲得大量無性株系，對木薯遺傳育種研究具有重要意義。【前人研究進展】目前，以植物細胞全能性為理論基礎的組織培養技術已日趨成熟。在適宜條件下，任何一個植物細胞均可發育成一個新植株（劉進平，2005；鄭成木和劉進平，2006），如把未成熟的種子幼胚體剝離出來，接種在人工合成的培養基上培養，可發育成正常植株，是解決種子敗育的有效途徑（Zhang et al.，2000；陳穎等，2011；宋劍靈等，2012；陸柳英等，2014；孫貝貝等，2016）。根據植物種子胚齡大小，種子胚培養可分為幼胚培養和成熟胚培養：幼胚培養不僅能克服遠緣雜交的不親和性，對雜交種子進行“胚挽救”，還能有效提高植株繁育率；成熟胚培養能有效提高種子發芽率和增殖率，“搶救”儲藏過久或儲藏不當的種子（賀濤等，2012）。宋劍靈等（2012）研究表明，不同發育期的木薯幼胚萌發率為5.00%～100.00%；趙珊珊等（2010）、郭軍輝（2012）利用木薯脆性胚性愈傷發生及芽器官發生誘導技術已建立成熟的木薯體細胞再生體系和遺傳轉化體系，不僅可獲得大量無性株系，還可對其進行遺傳改良，成功培育木薯新品種（系）。【本研究切入點】至今，尚無利用木薯雜交種子誘導體細胞胚胎發生及再生植株的研究報道。【擬解決的關鍵問題】以不同成熟度的華南5號（SC5）雜交種子組織為外植體材料，利用不同外源激素誘導其體細胞胚胎增殖、子葉器官形成、不定芽（莖葉器官）發生和生根，并比較不同外源激素的誘導效果，優化木薯種子體細胞胚胎誘導發生及其植株再生體系，為木薯種質創新和雜交育種提供技術支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

SC5由廣西木薯研究所提供，于2013-2015年在廣西亞熱帶作物研究所木薯種質圃和中國科學院（上海）植物生理生態研究所三亞大茅育種基地進行開放式雜交育種試驗，收集雜交種子。主要試劑：基礎培養基（MS）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸（Picloram）、6-芐基腺嘌呤（BAP）和a-萘乙酸（NAA）均購于上海美艾斯生物科技有限公司。主要儀器設備：高壓蒸汽滅菌鍋（LDZF-30KB）、超凈工作臺（SW-CJ-1FD/1F）和人工氣候培養箱（RQH-250）等。

1.2試驗方法

1.2.1培養基配制 由于2，4-D和Picloram可誘導植物體細胞胚胎發生，BAP和NAA可促進植物細胞分化和增殖，因此，本研究參照前人研究結果（趙珊珊等，2011；張東向等，2011；宋劍靈等，2012；陸柳英等，2014）對培養基的激素濃度進行改良?；九囵B基（M1）：基礎培養基（MS，含維生素）+2.00 μmol/LCuSO₄+2.00%蔗糖+0.30%Gelrite，pH 5.8；誘導膨大培養基（M2）：MI+10.00 mg/L BAP，pH 5.8；誘導體細胞胚胎發生培養基（M3）：M1+4.00 mg/L 2，4-D或12.00 mg/L Picloram，pH 5.8；誘導體細胞胚胎增殖培養基（M4）：MI+0.10 mg/L BAP或1.00 mg/L NAA或0.05 mg/L BAP+0.50 mg/L NAA，pH 5.8；誘導體細胞胚胎成熟培養基（M5）：M1+0.10 mg/L BAP+0.50 mg/L IBA，pH 5.8；誘導莖葉器官發生及生根培養基（M6）：M1+0.40 mg/L BAP，pH 5.8。

1.2.2樣品采集及前處理 采集不同成熟度的雜交種子組織，包括未成熟種子（圖1-A）子葉（a1）和胚芽（b1）、成熟種子（圖1-B）子葉（a2）和胚芽（b2）及誘導萌發種子（圖1-C）子葉（a3）、胚芽（b3）和胚軸（c3）。種子材料消毒處理：ddH20沖洗30 s，2次→無水乙醇浸泡沖洗10 s→ddH₂O沖洗30 s，2次→0.1%升汞浸泡沖洗（未成熟/成熟種子2 min，誘導萌發種子60 s）1次→ddH₂O沖洗30 s，2次→75%乙醇浸泡沖洗20 s，2次+ddH₂O浸泡沖洗30 s，2次→無菌濾紙吸干。在無菌條件下，解剖、切取子葉（a）、胚芽（b）和胚軸（c）（2.00～3.00 mm）為外植體材料，放置于M1上培養基上保濕，每皿10個外植體，3次重復。

1.2.3膨大誘導處理 將外植體置于M1進行預培養處理3 d，以無預培養材料為對照（CK），然后轉置于M2，26.0℃下16 h光/8 h暗、光照強度800～1000 lX培養1周；在體視顯微鏡下，用無菌針頭挑取無褐化的膨大材料（圖1-D和圖1-E）備用，并統計不同種子材料的污染率、褐化率及膨大率。

1.2.4體細胞胚胎發生誘導 將膨大材料轉置于M3，26.0℃下24 h暗培養2周。每隔3 d在體視顯微鏡下觀察體細胞胚胎的發生情況，當出現球型胚和魚雷型胚繭狀嵌合體（圖1-F和圖1-G），將其分離后于M3繼代培養，統計不同種子材料的出胚率。

1.2.5體細胞胚增殖培養 將體細胞胚胎轉置于M4，26.0 ℃下16h光/8 h暗培養，光照強度800～1000 lx，誘導體細胞胚胎分化、增殖（圖1-H和圖1-I），每2周繼代1次，觀察體細胞胚胎分化情況，統計不同種子材料的體細胞胚胎增殖率。

1.2.6體細胞胚胎成熟及子葉器官發生誘導 將2～3個體細胞胚胎組成的小團簇置于M5，26.0℃下24 h光培養，光照強度800-1000 lx培養，2周后觀察體細胞胚狀體成熟及不定芽誘導發生情況，直至觀察到出現有子葉明顯長大并變綠（圖1-J和圖1-K），再繼代培養，并及時處理褐化材料，統計不同種子材料的不定芽發生率。

1.2.7莖葉器官伸長及生根誘導 切取3.00～5.00cm長的成熟不定芽（圖1-L）或面積約0.04 cm2綠色子葉（圖1-M）置于M6，26.0℃下16 h光/8 h暗培養，光照強度800-1000 lx，每周繼代1次，3周后觀察莖葉器官伸長及生根情況（圖1-N和圖1-O），并統計不同種子材料的生根率。

1.2.8再生植株繼代培養 將再生植株小苗轉置于M1，26.0℃下16 h光/8 h暗培養，光照強度800～1000 lX，每2周繼代培養1次，繁育無性株系。

1.3統計分析

采用SAS 9.0和SPSS 19.0對試驗數據進行整理分析。

2結果與分析

2.1膨大誘導處理結果

通過外植體預培養可有效控制外植體污染率（<5.00%）和保持其生物活性（>90.00%）。將外植體置于M1預培養后，轉置于M2進行誘導膨大培養，結果表明，預培養材料的褐化率比CK降低30.00%～40.00%；預培養的a、b和c膨大率分別比CK提高6.67%～13.33%、6.67%～50.00%和20.00%，且同一成熟度種子材料的不同組織膨大率均存在顯著差異（P<0.05，下同），以a的膨大率最低（圖2）。綜上所述，外植體預培養可有效防止其褐化，提高其膨大誘導效果。

2.2體細胞胚胎發生誘導結果

將膨大外植體置于M3誘導其體細胞胚胎發生，結果表明，4.00 mg/L 2，4-D誘導下不同種子材料的出胚率存在一定差異，其中a1為0，a2為3.33%，a3為13.33%，b1為6.67%，b2為36.67%，b3為56.67%，c3為50.00%；12.00 mg/L Picloram誘導下不同種子材料的出胚率也存在差異，其中a1為0，a2為6.67%，a3為13.33%，b1為10.00%，b2為30.00%，b3為50.00%，c3為33-33%；4.00 mg/L 2，4-D和12.00 mg/L Picloram誘導下a1、a2和a3的出胚率均無顯著差異（P>0.05，下同）（圖3-A），而b1、b2和b3的出胚率均存在顯著差異（圖3-B）；4.00 mg/L 2，4-D誘導3的出胚率比12.00 mg/LPicloram提高了16.67%，但差異不顯著（圖3-C）。綜上所述，以b的出胚率較高，c次之，a較低，且4.00mg/L 2，4-D的體細胞胚胎發生誘導效果優于12.00mg/L Picloram，成熟度高的種子材料更有利于誘導體細胞胚胎發生。

2.3體細胞胚胎增殖培養結果

將體細胞胚胎置于M3誘導其分化、增殖，結果表明，0.10 mg/L BAP誘導下a、b和c的體細胞胚胎增殖率分別為26.67%，36.67%和33.33%；1.00 mg/LNAA誘導下a、b和c的體細胞胚胎增殖率分別為23.33%、36.67%和40.00%，0.10 mg/L BAP誘導下a、b和c的體細胞胚胎增殖率與1.00 mg/L NAA均無顯著差異；0.05 mg/L BAP+0.50 mg/L NAA誘導下a、b和c的體細胞胚胎增殖率分別為73.33%、83.33%和73.33%，比單獨使用0.10 mg/L BAP分別顯著提高46.66%、46.66%和40.00%，比單獨使用1.00 mg/LNAA分別顯著提高50.00%、46.66%和33.33%（圖4）。綜上所述，混合使用0.05 mg/L BAP和0.50 mg/LNAA能更有效地促進體細胞胚胎分化和增殖。

2.4體細胞胚胎成熟及子葉器官發生誘導結果

將體細胞胚胎小團簇置于M5誘導其成熟及子葉器官發生，結果表明，a2、a3、b1、b2、b3和c3的不定芽發生率分別為30.00%、40.00%、40.00%、53.33%、70.00%和13.33%，其中b3不定芽發生率顯著高于其他材料，b1、b2、a2和a3的不定芽發生率無顯著差異，a1、a2和c3間的不定芽發生率差異顯著（圖5）；誘導體細胞胚胎成熟較容易，但誘導子葉器官發生較難，誘導胚狀體不定芽形成存在明顯差異，多數以葉簇的形式生長（圖1-J），少數胚狀體相對獨立，發育成完整的綠色子葉（圖1-K）。綜上所述，對于同一組織，成熟度高的種子材料體細胞誘導不定芽發生效果優于成熟度低的種子材料，且不同成熟度的種子均以b最優。

2.5莖葉器官伸長及生根誘導結果

將成熟不定芽或綠色子葉置于M5進行培養，胚狀體子葉逐漸變粗、增長，發育為莖葉器官，而誘導其生根較難。由圖6可知，a2、a3、b1、b2、b3和c3的生根率分別為23.33%、23.33%、16.67%、30.00%、56.67%和0，其中b3的生根率顯著高于其他材料，a2、a3、b1和b2的生根率無顯著差異，c3未獲得誘導生根材料，表明對于同一組織，成熟度高的種子材料比成熟度低的種子材料更易誘導生根，發育更好，且不同成熟度的種子均1）Ab最優。綜上所述，7種不同成熟度的雜交種子材料中，a2、a3、b1、b2和b3經體細胞誘導獲得再生植株，成功率為71.43%。

2.6不定芽及再生株系的培養與擴繁

將不定芽及再生株系轉置于M1，每2周繼代培養1次，可有效獲得大量無性株系，a2、a3、b1、b2和b3的擴繁率無顯著差異。經過3次繼代培養，獲得了再生植株共269株，其中a2有40株，a3有52株，b1有43株，b2有66株和b3有68株。

3討論

目前，植物組織培養技術已日趨完善和成熟，但仍存在很多因素影響其成功率。其中，外植體材料是決定植物組織培養中植株繁殖速率和再生植株直立的重要因素。本研究選取外植體材料的理論依據：子葉為種子萌發提供養料，也是暫時性葉器官，幼苗出土后可進行光合作用；胚芽位于胚軸的頂端，具有極小幼葉（真葉—初生葉）包卷，萌發后發育成幼苗的葉和莖；胚軸為子葉著生點與胚根之間的軸體，發育成為連接莖和根的部分。結果表明，在不同木薯種子材料中，胚芽體細胞出胚率較高，胚軸次之，子葉較低，其原因是胚芽為細胞分化、發育最旺盛的組織部分。但對于同一組織，成熟度高的種子材料明顯優于成熟度低的種子材料。其次外植體消毒和滅菌處理是植物組織培養的關鍵，常用的消毒液為無水/75.0%乙醇和0.10%升汞，可使生物細胞內蛋白質變性、失活、致死，從而達到滅菌的目的，但對外植體材料有毒害作用，使其產生褐化、水漬狀壞死及腐爛。本研究根據外植體材料特點選擇最佳消毒劑量和消毒時間，外植體消毒均在無菌條件下進行，并在短時間內進行反復多次的液體浸泡沖洗（其中0.1%升汞1次，無水乙醇1次，75%乙醇2次，ddH₂O共8次，消毒時間控制在6～7 min），既有利于消毒液對有害生物的滅活、清除，還能及時去除殘留在外植體的消毒液，減少對其毒害作用，提高材料的使用效率。

此外，培養基中外源激素種類及濃度也是植物組織培養的重要影響因素。本研究將2，4-D和Piclo-ram添加至誘導培養基中，其原因是二者均可干擾植物體內激素平衡，影響核酸和蛋白質代謝，從而促進或抑制某些器官生長發育。已有研究表明，2，4-D既可誘導愈傷組織發生，也可抑制細胞進一步發育，而Picloram在誘導培養后期對體細胞胚胎的發育不具有明顯抑制作用（殷麗青等，2013）。本研究結果表明，2，4-D和Picloram可誘導體細胞胚狀體發生，與郭軍輝（2012）研究結果相符。本研究還發現，在培養基中添加BAP（0.10 mg/L）或NAA（1.00 mg/L）均可誘導木薯體細胞胚胎分化、增殖，但混合添加BAP（0.05 mg/L）和NAA（0.5 mg/L）可極顯著提高體細胞胚胎增殖率，進一步證實混合添加激素對植物體細胞胚胎分化增殖具有促進效應（別曉敏等，2011；時劍等，2011；張燕等，2013）。

4結論

以木薯雜交種子組織外植體經預培養可有效防止其褐化，提高膨大誘導效果。在實際生產中，應在培養基中添加4.00 mg/L 2，4-D進行體細胞胚胎發生誘導，混合添加0.05 mg/L BAP和0.50 mg/L NAA進行體細胞胚胎增殖培養，且應選擇成熟度高的種子材料（如萌發種子胚芽等）作為外植體材料。