植物系統與進化枇杷屬內栽培種和部分野生種ITS序列分析

陳灼娟

摘要： 對不同栽培區的25種普通枇杷品種以及7種枇杷屬野生種的ITS序列進行擴增并測序，采用鄰接法和最大簡約法進行系統發育樹的構建并對枇杷屬內不同種間的遺傳關系進行了分析。結果表明：枇杷屬植物ITS序列ITS1+5.8S rDNA+ITS2總長度為592 bp或594 bp，長度變化發生在ITS2。所有樣本的ITS1和5.8S rDNA長度一樣，都是223 bp和168 bp；而ITS2為201 bp或203 bp。5種枇杷屬野生種的ITS序列長度為594 bp，包括櫟葉枇杷、大渡河枇杷、南亞枇杷、南亞枇杷窄葉變種和大瑤山枇杷；其余2種枇杷屬野生種（麻栗坡枇杷、小葉枇杷）和普通枇杷栽培種的ITS序列長度都為592 bp。所有樣本ITS序列的GC含量為64.2%～64.5%，其中ITS1為64.1%～65.5%，ITS2為68.1%～72.6%。對所有樣本的ITS序列比對產生44個可變位點，其中38個為簡約信息位點，其中11個位于ITS1，5個位于5.8S rDNA，22個位于ITS2。最大的種間序列差異為7.7%，最小的種間差異發生在麻栗坡枇杷和小葉枇杷之間，僅為0.2%。普通枇杷種內的ITS序列差異很低，25種普通枇杷栽培種之間的序列差異為0～1.5%。所研究的枇杷屬植物可分為3個分支。分支Ⅰ包括所有普通枇杷品種，分支Ⅱ包含5種野生枇杷種，包括櫟葉枇杷、大渡河枇杷、南亞枇杷、南亞枇杷窄葉變種和大瑤山枇杷；分支Ⅲ由2個野生枇杷種（麻栗坡枇杷、小葉枇杷）組成。該研究結果表明ITS序列對枇杷種間鑒定和系統發育分析具有一定意義，但對普通枇杷栽培種間的鑒定作用不大。

關鍵詞： 枇杷屬， ITS序列， 變異位點， 系統發育

中圖分類號： Q781，Q949

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）11144708

Abstract： Internal transcribed spacer （ITS1， 5.8S rDNA and ITS2） regions of seven wild Eriobotrya species and twentyfive loquat （E. japonica） cultivars were cloned and sequenced. The phylogenetic tree was constructed by the Neighborjoining method and the maximum parsimony method， and phylogenetic relationships of different species of were studied in this work. The size of the ITS1+5.8S rDNA+ITS2 sequences was 592 bp or 594 bp. The length variation was found in ITS2. The length of ITS1 and 5.8S rDNA for all sample were identical， with a value of 223 bp and 168 bp. While ITS2 was 201 bp or 203 bp. The experimental data obtained from five wild Eriobotrya plants（E. prinoides， E. prinoides var. daduheensis， E. bengalensis， E. bengalensis f. angustifolia， E. dayaoshanensis） showed the same sequence length of 594 bp， while the others were 592 bp. Variation of GC contents has been also observed and scored as 64.1%-65.5% and 68.1%-72.6% for ITS1 and ITS2. The alignment of all the ITS sequences from Eriobotrya plants produced 44 variable sites with 38 parsimony of informative sites （ 11 in ITS1， 5 in 5.8S rDNA and 22 in ITS2 ）. The greatest interspecific sequence divergence was 7.7%. The lowest value （0.2%） occurred between E. malipoensis and E. seguinii showed the similar ITS sequence. We found that divergence among loquat （E. japonica） cultivars sequence was very low. The intraspecific sequence variabilities between twentyfive loquat （E. japonica） cultivars were 0-1.5%. All phylogenetic trees， by the Neighborjoining method and the maximum parsimony method， confirmed these Eriobotrya plants could be divided into three major clades. Clade Ⅰ contained all loquat （E. japonica） cultivars. Clade Ⅱ contained five wild species of Eriobotrya （E. prinoides， E. prinoides var. daduheensis， E. bengalensis， E. bengalensis f. angustifolia， E. dayaoshanensis）. Clade Ⅲ consisted of E. malipoensis and E. seguinil formed a basel clade. ITS data failed to resolve internal relationship within the Clade Ⅰ， an important clade since all loquat （E. japonica） cultivars analysed were in this clade. Our results strongly supported the efficiency of ITS sequence for the genetic diversity among Eriobotrya species， but use ITS sequence to identify the variety of loquat （E. japonica） cultivars did not appear to help.

Key words： Eriobotrya， ITS sequence， variation point， phylogeny

枇杷屬（Eriobotrya Lindl.）屬于薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae），有27～30種，主要分布在東亞和東南亞地區。普通枇杷（Eriobotrya japonica）由于其可食性而廣為人知。在中國，關于枇杷的記載可追溯到2000年前，中國擁有豐富的枇杷種質資源，種類多、分布廣。在古代，枇杷就被引種到國外，現在枇杷已在世界其他地區普遍種植（Soriano et al，2005）。為理解枇杷屬植物的分布和分類情況，學術界進行了大量的研究工作。在中國有大量的野生枇杷種質資源，并不斷有新的枇杷種被發現（Lin，1999）。但由于對野生枇杷的研究較少以及缺乏快速有效的鑒定工具，造成枇杷屬內種類的一些混亂（楊向暉等，2005）；而普通枇杷由于長期以來不同區域間經常相互引種栽培，果農自行定名推廣，導致枇杷品種出現同物異名和同名異物的混亂現象。所以，枇杷屬內植物的遺傳評價和物種鑒定對于資源的保護和利用尤為重要。

傳統的系統發育分析基于形態學特征進行，隨著分子生物學的發展，一些生物學標志如同工酶（方德秋和章恢志，1989）、等位酶（蔡禮鴻等，2005）、RAPD（Vilanova et al，2001）、AFLP（吳錦程等，2006）、SSR（Soriano et al，2005）等已被用于枇杷遺傳多樣性和種質鑒定研究中。ITS序列具有進化速率快、穩定性好和測序方便的優點，成為研究植物系統發育及分子進化的有效工具和重要標記，被廣泛應用于植物屬間、種間以及種內各栽培種間分類研究（Alvarez & Wendel，2003）。本研究測定了25種普通枇杷栽培種及7種枇杷屬野生種的ITS序列，并進行枇杷屬系統發育分析，研究枇杷屬內分類學關系，為枇杷屬物種多樣性保護、種質鑒別和栽培育種提供分子生物學工具和依據。

1材料與方法

1.1 材料

植物材料均采自國家果樹種質福州枇杷資源圃，包括25種普通枇杷栽培種，代表國內外不同的枇杷栽培區，還采集了7種枇杷屬野生種，采集時均采集樹上嫩葉，并立即保存于液氮中備用， 品種名稱、原產地詳見表1。本研究選取了與枇杷屬親緣關系近的蘋果屬的Malus fusca（GenBank No：AF186514）和李屬的Pyrus ussuriensis（GenBank No：EU150058）作為外類群。

OMEGA E.Z.N.A HP plant DNA Kit、OMEGA E.Z.N.A Gel Extraction Kit購自福州博鴻生物科技有限公司；即用PCR擴增試劑盒及部分藥品購自上海生工生物工程有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。ITS引物采用White et al（1990）設計的通用引物ITS1和ITS4，引物ITS1和引物ITS4分別位于18S和28S rDNA片段上，可擴增全長ITS1、5.8S rDNA和ITS2序列。

1.2 方法

1.2.1 枇杷葉基因組DNA的提取和檢測液氮中研磨枇杷葉至粉末，應用E.Z.N.A HP plant DNA Kit進行DNA提取，具體操作參照試劑盒說明書。提取到的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.2 PCR擴增PCR擴增應用上海生工即用PCR試劑盒進行，反應體系包含25 μL 2 × PCR Master （含MgCl2）、1 μL Primer ITS1（20 μmol·L1）、1 μL Primer ITS4（20 μmol·L1）、50 ng枇杷葉基因組DNA。反應程序為94 ℃預變性10 min；94 ℃變性1 min、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30 cycles；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PCR產物回收與測序PCR產物使用OMEGA E.Z.N.A Gel Extraction Kit進行回收純化，回收產物直接測序，測序工作委托上海生工生物工程有限公司進行。

1.2.4 數據分析ITS1、5.8S和ITS2的邊界由已知Eriobotrya japonica ITS序列（GenBank No：U16192）和近緣種已經發表的ITS序列來界定，利用CLUSTAL X v.1.81（Thompson et al，1997）進行序列排列，并進行手工校正。利用MEGA v.4.0.2（Tamura et al，2007）對ITS1、5.8S和ITS2三個區域GC含量和核苷酸替代率進行計算，并根據Kimura二參數模型構建鄰接樹。此外，還利用PAUP 4.0 beta 10 win（Swafford，2002）軟件對所有序列進行最大簡約樹的構建，所有特征狀態指定為無序（random），空位作缺失（missing）狀態分析。最大簡約樹的構建使用啟發式（heuristic）搜索（100隨機添加序列重復），樹二等分再連接分支交換（TBR），各種核苷酸替代同等加權，使用自展法（bootstrap）檢驗MP樹可靠性（重復1 000次）。

2結果與分析

2.1序列長度和GC含量

本研究中所有樣品ITS序列已提交至GenBank，詳見表1。通過對序列長度和GC含量分析發現，所研究枇杷屬植物整個ITS序列包括ITS1、5.8S rDNA和ITS2長度為592 bp或594 bp（表2）。其中，來自5種野生枇杷：南亞枇杷（Eriobotrya bengalensis）、南亞枇杷窄葉變種（E. bengalensis f. angustifolia）、櫟葉枇杷（E. prinoides）、大渡河枇杷（E. prinoides var. daduheensis）、大瑤山枇杷（E. dayaoshanensis）的ITS序列長度都為594 bp。其余2種野生枇杷：麻栗坡枇杷（E. malipoensis）和小葉枇杷（E. seguinii）及25種普通枇杷（E. japonica）栽培種的ITS序列長度都為592 bp。長度變異區域發生在ITS2區，變異發現為一個GC的插入（圖1）。所研究的枇杷屬植物的ITS序列GC含量在64.2%～64.5%之間，其中ITS1為64.1%～65.5%，ITS2為68.1%～72.6%。

2.2 序列差異性

本研究所采集的枇杷屬植物的ITS序列比對發現存在44個變異位點，信息位點為38個，其中11個位于ITS1，5個在5.8S，22個位于ITS2。種間最大的序列差異為7.7%，最小的差異是在麻栗坡枇杷和小葉枇杷之間，僅有0.2%。櫟葉枇杷和大渡河枇杷序列同源率為99.3%，南亞枇杷和南亞枇杷窄葉變種序列同源率為99.2%，序列數據差異與其品種分類一致。

研究發現在普通枇杷各品種間的ITS序列差異較小，差異值在0～1.5%之間；差異位點發生在ITS2，大部分栽培種表現為相同的ITS序列，表明ITS序列在普通枇杷種內具有高度保守性。

2.3 ITS序列的系統發育分析

本研究基于ITS序列構建了枇杷屬內系統發育樹。鄰接樹應用 Kimura二參數法構建 （圖2）。在應用最大簡約法構建系統樹過程中，啟發性搜索（heuristic searches）產生95棵最大簡約樹，其一致性指數（CI）為0.884 2，保留指數（RI）為0.938 9（圖3）。這兩種方法構建的系統樹都把本研究所采集的樣品分為3個分支。第一個分支（Clade Ⅰ）包含了所有的普通枇杷品種，包括栽培種和一些野生種，處于該分支基部的是栽培種貴州野生，由于普通枇杷種內ITS序列差異較小，故系統樹并沒有將這些品種完全分開。第二分支（Clade Ⅱ）包含櫟葉枇杷、大渡河枇杷、南亞枇杷、南亞枇杷窄葉變種和大瑤山枇杷，這5種枇杷都是枇杷屬內的野生種。第三分支（Clade Ⅲ）中包含麻栗坡枇杷和小葉枇杷，這個分支處于整個系統樹的基部。

3討論

3.1 ITS的進化

枇杷屬植物的ITS1序列長度為223 bp，ITS2比ITS1短20 bp或22 bp。得到的枇杷屬植物ITS序列的總長與其他被子植物特別是薔薇科植物相近（ITS1：187～298 bp，ITS2：187～252 bp）（Campbell et al，1995）。枇杷屬ITS序列比對的結果顯示長度變異發生在ITS2，表現為1個GC的插入，這種插入可能是基因滑動，一種DNA錯配突變過程的結果（Gillespie，2004）。

在枇杷屬植物中，ITS2的GC含量比ITS1高2%～5%；ITS2的差異水平比ITS1高出兩倍。這表明ITS2進化速度比ITS1快（Torres et al，1990）。在普通枇杷種內ITS1幾乎相同而變異位點都處在ITS2區，也驗證了這個結論。

3.2 ITS序列在枇杷屬系統發育分析中的應用

ITS序列的變異速率為許多被子植物類群的系統發育研究提供了較豐富的變異位點和信息位點。在薔薇科（Rosaceae）植物中，ITS序列已經成功應用于蘋果亞科（Maloideae）（Campbell et al，1995）、唐棣屬（Amelanchier）（Campbell et al，1997）、蘋果屬（Malus）（Robinson et al，2001）、梨屬（Pyrus）（Zheng et al，2008）等植物類群的系統發育分析中。目前，在分子水平對枇杷屬系統發育學的研究還較少。DNA序列比對可以讓我們深入認識枇杷屬各種之間的系統發育關系。本研究的主要目的是將ITS序列分析引入到枇杷屬遺傳關系評估體系中。本研究所采集枇杷屬植物的ITS序列比對發現比對矩陣存在44個可變位點，其中信息位點為38個，這表明ITS序列在對枇杷種間的鑒定與關系評估具有可觀的價值。ITS序列分析也顯示了某些枇杷栽培種在形態學上差異較大，而在DNA水平上同源性卻很高。ITS序列的分析可以提供給我們一個方便的評估枇杷種間關系的工具。但是，在普通枇杷栽培種之間，ITS序列的差異性很小，表明這些栽培種在遺傳關系上非常相近。這也可能是因為這些栽培種都來自同一祖先，而相互之間雜交頻繁。應用ITS序列無法將所有的栽培種分開，故ITS序列無法有效應用于普通枇杷栽培種進行品種鑒定。通過ITS序列分析枇杷屬種間遺傳關系，可以有目的地選擇親緣關系較遠的非栽培種作為親本進行雜交育種，使優良、獨特基因得到有效轉移。

3.3 普通枇杷的起源

在枇杷屬系統發育學研究中，普通枇杷的起源是一個富有爭議的課題。方德積和章恢志（1989）在大渡河流域發現一種新的枇杷野生種，命名為大渡河枇杷，在研究大渡河枇杷形態學、孢粉學及同工酶后，認為大渡河枇杷可能是普通枇杷的祖先之一；而唐蓓（1997）在對普通枇杷、大渡河枇杷和櫟葉枇杷的核型及過氧化物同工酶分析后，認為大渡河枇杷可能來源于普通枇杷與櫟葉枇杷的雜交種；楊向暉等（2007）基于RAPD和AFLP對普通枇杷、大渡河枇杷和櫟葉枇杷進行的研究支持了后者關于大渡河枇杷是櫟葉枇杷和普通枇杷雜交種的觀點。本研究發現大渡河枇杷與櫟葉枇杷在ITS序列上同源率非常高，而與普通枇杷的親緣關系較遠，故支持大渡河枇杷是櫟葉枇杷一個變種的觀點。但是，關于大渡河枇杷是普通枇杷祖先的觀點還需進一步論證。

參考文獻：

AlVAREZ I，WENDEL JF， 2003. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference [J]. Mol Phylogenet Evol，29（3）：417-34.

CAI LH，LI ZZ，HUANG HW，et al， 2005. Genotype fingerprint of loquat cultivars and allozymic variation in Eriobotrya [J]. J Wuhan Bot Res，23（5）：406-416. [蔡禮鴻，李作洲，黃宏文，等， 2005. 枇杷屬植物等位酶遺傳變異及品種基因型指紋 [J]. 武漢植物學研究， 23（5）：406-416.]

CAMPBELL CS，DONOGHUE MJ，BALDWIN BG，et al，1995. Phylogenetic relationships in Maloideae （Rosaceae）：evidence from sequences of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA and its congruence with morphology [J]. Am J Bot，82（7）：903-918.

CAMPBELL CS，WOJCIECHOWSKI MF，BALDWIN BG，et al，1997. Persistent nuclear ribosomal DNA sequence polymorphism in the Amelanchier agamic complex （Rosaceae） [J]. Mol Biol Evol，14（1）：81-90.

FANG DQ ， ZHANG HZ， 1989. Peroxidase isozymes in Eriobotrya [J]. J Huazhong Agric Univ，8（2）：144-150. [方德秋，章恢志， 1989. 枇杷屬植物過氧化物酶同工酶研究 [J]. 華中農業大學學報，8（2）：144-150.]

GILLESPIE JJ，2004. Characterizing regions of ambiguous alignment caused by the expansion and contraction of hairpinstem loops in ribosomal RNA molecules [J]. Mol Phylogenet Evol，33（3）：936-943.

LIN SQ， 1999. Loquat：botany and horticulture [J]. Hortic Rev，23：233-276.

ROBINSON JP，HARRIS SA， JUNIPER BE， 2001. Taxonomy of the genus Malus Mill.（Rosaceae） with emphasis on the cultivated apple， Malus domestica Borkh [J]. Plant Syst Evol，226（1）：35-58.

SORIANO JM，ROMERO C，VILANOVA S，et al，2005. Genetic diversity of loquat germplasm （Eriobotrya japonica（Thunb） Lindl） assessed by SSR markers [J]. Genome，48（1）：108-140.

SWAFFORD D，2002. PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony（*and other methods） [M]. Ver. 4， Sunderland： Massachusetts： Sinauer Associates.

TAMURA K，DUDLEY J，NEI M，et al，2007. MEGA4：molecular evolutionary genetics analysis（MEGA） software version 4.0 [J]. Mol Biol Evol，24（8）：1596-9.

TANG B， 1997. Astudy of the sibship among Eriobotrya japonica Lindl， E. prinoides Rehd. & wils. var. daduheensis H. Z. Zhang and E. prinoides Rehd. & Wils [J]. J Chongqing Norm Univ（Nat Sci Ed），14（3）：18-25. [唐蓓， 1997. 普通枇杷、大渡河枇杷、櫟葉枇杷的親緣關系探討 [J]. 重慶師范學院學報（自然科學版），14（3）： 18-25.]

THOMPSON JD，GIBSON TJ，PLEWNIAK F，et al，1997. The CLUSTAL_X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools [J]. Nucleic Acids Res，25（24）：4876-4882.

TORRES RA，GANAL M，HEMLEBEN V， 1990. GC balance in the internal transcribed spacers ITS 1 and ITS 2 of nuclear ribosomal RNA genes [J]. J Mol Evol，30（2）：170-181.

VILANOVA S，BADENES ML，MARTINEZCALVO J，et al，2001. Analysis of loquat germplasm （Eriobotrya japonica Lindl） by RAPD molecular markers [J]. Euphytica，121（1）：25-29.

WHITE T，BRUNS T，LEE S，et al，1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics in PCR protocols：a guide to methods and applications [M]. New York： Academic Press：315-322.

WU JC，YANG XH，LIN SQ，2006. Establishment of AFLP ananlysis system and its application in loquat germplasm [J]. J Fruit Sci， 23（5）：774-778. [吳錦程，楊向暉，林順權， 2006. 枇杷AFLP分析體系的建立與應用 [J]. 果樹學報，23（5）：774-778.]

YANG XH，GLAKPE K，LIN SQ，et al， 2005. Taxa of plants of genus Eriobotrya around the world and native to Southeastern Asia [J]. J Fruit Sci， 22（1）：55-59. [楊向暉，格拉貝，林順權，等， 2005. 枇杷屬植物種類數及東南亞原產枇杷種類 [J]. 果樹學報，22（1）：55-59.]

YANG XH， LIU CM， LIN SQ， 2007. The genetic relationship among common loquat，daduhe loquat and oakleaf loquat，according to RAPD and AFLP analysis [J]. Subtrop Plant Sci，36（2）：9-12. [楊向暉，劉成明，林順權， 2007. 普通枇杷、大渡河枇杷和櫟葉枇杷遺傳關系研究—基于RAPD和AFLP分析 [J]. 亞熱帶植物科學，36（2）：9-12.]

ZHENG X， CAI D， YAO L， et al， 2008. Nonconcerted ITS evolution， early origin and phylogenetic utility of ITS pseudogenes in Pyrus [J]. Mol Phylogenet Evol， 48（3）：892-903.