α-硫辛酸對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓內NF-κB表達的影響

檀紅玲，梁丹，檀國軍，馬玉騰，韓梅，高夢穎，張軍立

多發(fā)性硬化是最為常見的一種中樞神經脫髓鞘疾病，急性活動期中樞神經白質區(qū)可見大量炎性脫髓鞘斑，而陳舊病變因膠質纖維增生而形成鈣化斑，以多發(fā)病灶、緩解—復發(fā)病程為特點[1]。α-硫辛酸(α-LA)是一種強效抗氧化劑，近年來，研究發(fā)現α-LA還具有抗炎和神經保護作用[2-3]，但具體機制尚不完全清楚。核因子κB(NF-κB)是細胞中廣泛存在的轉錄因子，靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制蛋白IκB形成復合物存在于胞漿，經感染、氧化應激、脂多糖等刺激后可活化NF-κB產生多種細胞因子，參與炎性反應[4]。本研究旨在通過檢測脊髓中NF-κB及其抑制蛋白IκB的表達，進一步探討α-LA對自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠的可能保護機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：成年雌性Wistar大鼠42只，體質量180～200 g；豚鼠10只，體質量400 g左右，雌雄不限；均購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(冀)2019-0102，實驗動物于SPF級動物房中適應性飼養(yǎng)3 d，自由攝食飲水。(2)試藥試劑：α-LA購自香港吉斯恩貝國際貿易有限公司，完全福氏佐劑、4%多聚甲醛、3%甲醇、雙氧水、枸櫞酸購自上海高創(chuàng)化學科技有限公司，DAB顯色試劑盒、NF-κB、IκB抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，山羊血清封閉液、NF-κB、IκB一抗、生物素化二抗購自沈陽萬類生物科技有限公司，ELISA試劑盒[白介素(IL)-2、IL-1β和腫瘤壞死因子α(TNF-α)]購自Cusabio公司。(3)儀器設備：BX51光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，5810離心機(德國艾本德公司)。

1.2 實驗方法 2019年1—12月于河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經病學實驗室進行實驗。

1.2.1 模型建立[5]：豚鼠麻醉狀態(tài)下，于背部切口取脊髓，小心剔除脊膜和血管，冰浴中將脊髓與生理鹽水充分混合制備為50 %(質量/體積)脊髓生理鹽水勻漿(GPSCH)，再加入等體積完全福氏佐劑(CFA，含4 mg/ml卡介苗)制成油包水抗原乳劑，完全乳化的標準為取乳化劑滴入清水中不散開。將油包水抗原乳劑注入大鼠四足掌膠質墊內，每只0.4 ml，注射后按壓針眼以免乳化劑外漏，建立EAE動物模型。

1.2.2 實驗分組：將成年健康雌性Wistar大鼠42只，隨機數字表法分為空白對照組(NC組)6只，不予任何處理；36只大鼠用新鮮豚鼠GPSCH誘導免疫，待大鼠發(fā)病后隨機分為EAE組、α-LA組，每組18只。α-LA組于發(fā)病后每日腹腔注射α-LA 100 mg/kg ，1次/d，共注射7 d；EAE組和NC組則每日腹腔注射等體積的生理鹽水，共注射7 d。其中EAE組和α-LA組再按發(fā)病、緩解、復發(fā)3個時點即發(fā)病后0 d、、7 d、14 d，每個時間點隨機選取6只大鼠觀察行為學及病理變化。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 神經功能評分： 每日觀察大鼠體質量及精神狀態(tài)、活動度等進行神經功能評分，采用國際通用的Kono評分標準[6]，其中1分為大鼠尾部無力，2分為大鼠尾部無力+肢體無力，3分為大鼠肢體輕度麻痹，4分為大鼠肢體嚴重麻痹且被動翻身后不能復原，5分為大鼠處于瀕死狀態(tài)或死亡。

1.3.2 組織病理學觀察： 大鼠麻醉狀態(tài)下，快速取其脊髓腰膨大組織，4%多聚甲醛固定，制備成組織石蠟切片，行改良的三色染色，光學顯微鏡下觀察病理學改變。

1.3.3 NF-κB、IκB檢測：制備6 μm的大鼠脊髓腰膨大組織橫截面切片，65℃烘烤脫蠟后水化，室溫下3%甲醇雙氧水孵育20～30 min；采用熱修復法，將切片置于適量枸櫞酸溶液中沸騰3～5 min；拿出切片放入冷水中冷卻，再在切片上滴加山羊血清封閉液，室溫下孵育20～30 min；然后在切片上滴加一抗，4℃孵育過夜；次日清洗后在切片上滴加生物素化二抗，37℃孵育20 min；清洗后在切片上滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20 min；按照DAB顯色試劑盒說明書，進行DAB顯色；蘇木精復染，脫水透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察NF-κB、IκB的表達情況。應用漢化版Image-Pro Plus v 5.1軟件(美國Media Cybernetics)進行圖像分析[7]，選取陽性表達最強的5個視野進行計算，得出陽性細胞數及陽性細胞顯色強度，從而得出免疫組化評分(IHS)的數值。染色評分[8]：以陽性細胞數評分與陽性細胞顯色強度評分的乘積為最終得分；陽性細胞數分級：0～1%計0分，1%～10%計1分，10%～50%計2分，50%～80%計3分，80%～100%計4分；陽性細胞顯色強度分級：陰性計0分，弱陽性計1分，陽性計2分，強陽性計3分。

1.3.4 血清炎性因子檢測： 動物麻醉狀態(tài)下，采集左心房血2 ml，離心分離上層血清。采用ELISA法檢測大鼠血清IL-2、IL-1β和TNF-α的水平。參照ELISA試劑盒說明書操作。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況及神經功能評分比較 NC組大鼠精神狀況良好，毛發(fā)光亮，進食飲水正常，體質量呈緩慢增長；EAE組大鼠免疫后開始出現精神萎靡、毛發(fā)不光滑、食欲不振及體質量減輕等，第9天時開始有發(fā)病癥狀：后肢無力和尾部癱瘓，嚴重時雙后肢甚至四肢癱瘓，大小便失禁，處于瀕死狀態(tài)。 α-LA組大鼠免疫后第12 d開始出現上述癥狀，但癥狀較EAE組有所改善。與EAE組比較，α-LA組大鼠發(fā)病后0、7及14 d時神經功能評分均降低(P<0.01)，見表1。

表1 大鼠發(fā)病不同時間點神經功能評分比較分)

2.2 各組大鼠脊髓腰膨大組織病理學變化比較 NC組大鼠脊髓腰膨大組織著色均勻，結構完整，未見明顯異常；EAE組出現明顯的“袖套樣”改變，伴有大量的炎性細胞浸潤；α-LA組仍可見大鼠“袖套樣”改變和炎性細胞浸潤，但病理組織改變較EAE組輕，2組各時期病理組織變化差異不明顯，見圖1。

2.3 各組大鼠NF-κB和IκB表達比較 與NC組比較，EAE組NF-κB表達水平發(fā)病后0 d時較高、7 d時減低、14 d時升高接近0 d時，IκB變化趨勢則與之相反；α-LA組發(fā)病后0 d時NF-κB表達水平較高，隨時間延長呈持續(xù)降低趨勢，IκB變化趨勢則與之相反。與EAE組比較，α-LA組各時期NF-κB表達均降低，IκB表達均升高(P<0.05)，見圖2、3及表2。

表2 各組大鼠NF-κB和IκB表達的免疫組化評分比較分)

2.4 各組大鼠血清炎性因子水平比較 EAE組血清IL-2、IL-1β和TNF-α水平發(fā)病后0 d時較高、7 d時減低、14 d時升高接近于0 d時， α-LA組發(fā)病后0 d時上述因子處于較高水平，隨時間延長呈持續(xù)降低趨勢。與NC組比較，EAE組血清IL-2、IL-1β和TNF-α水平均升高(P<0.05)；與EAE組比較，α-LA組各時點血清炎性因子水平均降低(P<0.05)，見表3。

3 討 論

多發(fā)性硬化是一種自身免疫性疾病，因其緩解—復發(fā)的病程特點，會造成不可逆性神經損傷，嚴重影響患者生活質量。目前，多發(fā)性硬化的治療以減輕癥狀為主，緩解時期的治療圍繞降低復發(fā)率、延緩疾病的進程展開，緩解期常用藥物有干擾素、免疫抑制劑等，但此類藥物價格昂貴，且大多會有不同程度的不良反應，影響其臨床實用性[9]。因此，開發(fā)多發(fā)性硬化的治療藥物仍是近年來的研究熱點。關于多發(fā)性硬化的發(fā)病機制尚不完全清楚，但眾多研究指出，多發(fā)性硬化屬于免疫因素介導的炎性反應性病變，而炎性細胞浸潤是多發(fā)性硬化最具標志性的特征之一[10]。其主要發(fā)病機制為：外部因素刺激T細胞的活化，使其進入腦組織分泌大量的炎性細胞因子，進一步促進B細胞和巨噬細胞的活化，并募集外周血中的T淋巴細胞、單核細胞及B淋巴細胞等至反應區(qū)域，最終導致中樞神經損傷[11]。NF-κB是重要的核轉錄因子，可啟動細胞炎性反應。Zhang等[12]研究指出，NF-κB通路在EAE大鼠中特異性激活，而敲除NF-κB后EAE大鼠血腦屏障破壞及炎性損傷明顯減輕，表明NF-κB參與EAE的發(fā)病過程。

α-LA是臨床應用廣泛且安全性較高的常見藥物，主要應用于改善糖尿病患者周圍神經病變[13-14]。近年來，大量研究結果顯示，α-LA除抗氧化作用外，還兼具抗炎和神經保護的作用[15-16]。Khalili等[17]研究表明，α-LA對多發(fā)性硬化患者有較好的療效，但α-LA的具體保護機制還不清楚。EAE動物模型與人類多發(fā)性硬化具有相似的臨床、免疫及病理特征。本研究通過對Wistar大鼠注射豚鼠新鮮的脊髓生理鹽水勻漿液，成功構建EAE大鼠模型，免疫后的大鼠于第9 d時開始有后肢無力和尾部癱瘓等癥狀，并具有緩解—復發(fā)的發(fā)病特點，與文獻報道相符[18]。通過評價各組大鼠神經功能評分，發(fā)現對于EAE大鼠緩解和復發(fā)時期，α-LA均可明顯減輕大鼠神經功能損傷，改善脊髓腰膨大組織病理學變化，與Waslo等[19]研究結果相符。NF-κB在自身免疫功能中有重要作用，正常狀態(tài)下NF-κB與其抑制蛋白IκB結合形成復合物存在于胞漿中，胞外刺激可降解IκB而激活NF-κB，后者以二聚體形式進入胞核介導炎性反應。本研究結果顯示，NF-κB/IκB及相關炎性因子(IL-2、IL-1β及TNF-α)水平在EAE大鼠中的表達與其病情緊密相關，發(fā)病高峰期NF-κB及炎性因子表達高，緩解期表達降低，而復發(fā)期又升高，IκB的表達趨勢則與之相反，進一步驗證了NF-κB介導炎性反應參與疾病的發(fā)生發(fā)展。EAE大鼠經α-LA處理后，各時期NF-κB和炎性因子的表達明顯降低，IκB的表達明顯升高，說明α-LA通過調控NF-κB/IκB的表達，在EAE大鼠中發(fā)揮抗炎作用，保護大鼠神經損傷，這與Zhang等[20]報道α-LA可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，發(fā)揮抗炎作用相符。

注：箭頭指示“袖套樣”改變和炎性細胞浸潤

圖2 各組大鼠脊髓腰膨大組織中NF-κB表達情況(DAB染色，×400)

圖3 各組大鼠脊髓腰膨大組織中IκB表達情況(DAB染色，×400)

表3 各組大鼠不同時點血清炎性因子水平比較

綜上所述，α-硫辛酸可明顯減輕EAE大鼠神經損傷，其抗炎機制可能與下調NF-κB表達，并上調IκB表達有關，后期將深入探討α-硫辛酸在EAE大鼠中的抗炎作用機制，為α-硫辛酸用于多發(fā)性硬化的臨床治療提供參考。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

檀紅玲、梁丹：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；檀國軍：課題設計；馬玉騰：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核;韓梅、高夢穎：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;張軍立：進行統(tǒng)計學分析