鹽酸法舒地爾對蛛網膜下腔出血大鼠學習記憶功能及海馬CA1區自噬的影響

孫林林，劉振剛，張志勇，陳揚，劉俊杰，付愛軍，李建民

鹽酸法舒地爾對蛛網膜下腔出血大鼠學習記憶功能及海馬CA1區自噬的影響

孫林林1，劉振剛1，張志勇2，陳揚2，劉俊杰1，付愛軍2，李建民2

目的研究鹽酸法舒地爾對蛛網膜下腔出血(SAH)大鼠學習記憶及海馬CA1區自噬的影響。方法雄性Sprague-Dawley大鼠54只，隨機分為假手術組、SAH組、藥物組，各18只。頸內動脈刺破法造模，藥物組造模成功后予鹽酸法舒地爾10 mg/ kg腹腔注射，每天1次，假手術組和SAH組腹腔注射等量生理鹽水，干預后6 h、24 h、72 h予穿梭箱試驗；取海馬CA1區組織HE染色觀察細胞形態，免疫組織化學染色觀察Beclin-1和微管相關蛋白l輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)的表達。結果與假手術組相比，SAH組大鼠各時間點穿梭箱試驗逃避反應次數減少(P<0.05)，逃避反應時間延長(P<0.05)；海馬CA1區神經細胞數目減少(P<0.05)，Beclin-1、LC3-Ⅱ表達增高(P<0.05)。與SAH組相比，藥物組各時間點逃避反應次數增多(P<0.05)，逃避反應時間減少(P<0.05)；海馬CA1區神經細胞增多(P<0.05)，Beclin-1、LC3-Ⅱ表達進一步增多(P<0.05)。結論鹽酸法舒地爾可改善SAH大鼠學習記憶功能，減少神經細胞損傷，增強海馬CA1區自噬。

蛛網膜下腔出血；鹽酸法舒地爾；學習記憶；自噬；大鼠

[本文著錄格式]孫林林，劉振剛，張志勇，等.鹽酸法舒地爾對蛛網膜下腔出血大鼠學習記憶功能及海馬CA1區自噬的影響[J].中國康復理論與實踐,2017,23(3):257-262.

CITED AS:Sun LL,Liu ZG,Zhang ZY,et al.Effects of fasudil hydrochloride on learning and memory ability and autophagy in CA1 area of hippocampus in subarachnoid hemorrhage rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(3):257-262.

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是指顱內血管病變致使血液流入蛛網膜下腔，是比較常見的腦血管疾病，發病率隨年齡增長而增加，老年發病較多，一般預后較差，是腦卒中猝死的最常見原因[1]。早期研究主要集中在血管痙攣方面，但治療對預后的改善并不明顯。新近研究表明，針對SAH早期腦損傷積極治療，可明顯改善患者的預后。文獻報道[2-3]，SAH早期的腦損傷通過細胞凋亡、細胞缺血及炎癥反應等各種途徑導致細胞的早期死亡。近期研究發現，神經系統疾病的發病機制與自噬有關，例如缺血性腦卒中[4]、腦外傷[5]等?？赡苁且驗樽允煽梢跃S持內環境穩定，減少神經細胞的損傷和凋亡。

鹽酸法舒地爾是臨床比較常用的藥物，其代謝產物為羥基法舒地爾，可影響神經細胞損傷、凋亡等病理生理改變。國外學者認為其對自噬的激活可能也發揮一定的作用。

本研究探討鹽酸法舒地爾對SAH大鼠學習記憶功能及海馬CA1區Belin-1和微管相關蛋白l輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3 II, LC3-Ⅱ)的影響，為探索SAH的臨床救治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

手術顯微鏡、組織包埋機、HI1220烘片機：德國LEICA公司。BX53全自動顯微鏡掃描系統：日本OLYMPUS公司。穿梭箱：上海軟隆科技發展有限公司。

鹽酸法舒地爾：山西普德藥業股份有限公司。自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ一抗：日本株式會社醫學生物研究所。免疫組織化學二抗：ZSGB-BIO公司。蘇木素、伊紅、酒精：華北理工大學基礎實驗室。

1.2 動物與分組

華北理工大學動物實驗中心提供SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠54只，月齡3~6個月，體質量360~470 g。自由進食水適應性飼養2周，實驗前12 h取出準備，術前禁食水。

大鼠依次編碼，隨機數字表法分為假手術組、SAH組、藥物組，各18只。各組再分為術后6 h、24 h、72 h共3個亞組，每個亞組6只。

1.3 模型制作

參考Muroi等[7]方法，采用頸內動脈刺破法制備大鼠SAH模型。10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，四肢及頭部固定，頸部備皮，消毒鋪洞巾；頸正中切口，暴露頸總、頸內、頸外動脈，結扎并離斷頸外動脈，纖芯從頸外動脈殘端刺入，進入頸內動脈，進入約2 cm后刺破血管，停留10 s左右，拔出纖芯，逐層縫合。保溫復蘇后繼續飼養。

造模成功判斷標準：①血管刺破感；②短暫的瞳孔散大；③剝離腦組織時肉眼可見血凝塊散布環池、基底池部位。

假手術組不刺破血管，余操作同前。

造模成功縫合切口后，藥物組予鹽酸法舒地爾10 mg/kg腹腔注射，6 h和24 h組各給藥1次，72 h組每24 h給藥1次，共3次。

1.4 穿梭箱試驗

大鼠術前1 d行穿梭箱訓練2次。術后于預設時間，適應環境5 min后，予聲光刺激5 s培養條件反射環境，再予1.5 mA交流電30 s電擊，休息20 s后進行下次練習，循環30次。視頻分析行為結果。記錄逃避反應次數(大鼠受30 s電刺激時間內逃離危險區的次數)和逃避反應時間(大鼠受30 s電刺激時間內逃離危險區的平均時間)。

1.5 HE染色

穿梭箱試驗后，每只大鼠予10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，心臟灌注生理鹽水500 ml，4%多聚甲醛250 ml灌注固定取腦，4%多聚甲醛浸泡固定2 d。切取帶有海馬的腦組織，石蠟包埋，切片厚5 μm。每個組織塊取3張帶海馬CA1區的切片，二甲苯、梯度酒精脫蠟，水化，蘇木素染胞核，伊紅染胞漿，梯度酒精、二甲苯脫水透明，封片。400倍光鏡下觀察海馬CA1區神經細胞，隨機選取6個視野采集圖片，Motic-6.0軟件計算正常形態神經細胞平均數。

1.6 免疫組織化學染色

每個組織取6張帶海馬CA1區的切片，二甲苯、梯度酒精脫蠟，水化，置檸檬酸鈉溶液中高壓修復，3%H2O2去離子水室溫孵育8 min，滴加LC3-Ⅱ一抗(1∶100)、Beclin-1一抗體(1∶100)，4℃冰箱過夜；滴加組化二抗，37℃恒溫箱孵育30 min；梯度酒精、二甲苯脫水透明，封片。400倍光鏡下觀察海馬CA1區神經細胞，隨機選取6個視野采集圖片，Motic-6.0軟件計算陽性細胞平均數。

1.7 統計學分析

實驗數據用EXCEL 2007軟件建立數據庫，SPSS 13.0軟件對實驗數據進行處理。所得數據均以(±s)表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 穿梭箱試驗

與假手術組比較，SAH組各時間點逃避反應次數減少，逃避反應時間增多(P<0.05)。與SAH組比較，藥物組各時間點逃避反應次數增多，逃避反應時間減少(P<0.05)。見表1、表2。

2.2 HE染色

假手術組海馬CA1區多正常形態神經細胞，排列整齊，胞核清晰，胞漿均勻。SAH組海馬CA1區神經細胞核紫色深染，排列紊亂，梭形固縮多見；6 h亞組即可見核固縮、核碎裂，正常神經細胞數目減少；24 h亞組正常神經細胞數目更少，72 h亞組核固縮、核碎裂較明顯，正常神經細胞數目最少。藥物組與SAH組比較，各時間點正常神經細胞數目明顯增多，核固縮、核碎裂明顯減少。見圖1、表3。

2.3 免疫組織化學染色

Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白陽性表現為細胞質中淺棕色、棕褐色顆粒。假手術組少數細胞質里可見陽性表達。SAH組6 h即可見細胞質中棕色顆粒，陽性細胞數量開始增多，24 h達到高峰，72 h減少。藥物組各時間點Beclin-1、LC3-Ⅱ陽性細胞數均比SAH組增多。見圖2、圖3及表4、表5。

圖1 各組海馬CA1區神經細胞形態(HE染色，bar=50 μm)

表1 各組術后不同時間穿梭箱試驗逃避反應次數比較

表2 各組術后不同時間穿梭箱試驗逃避反應時間比較(s)

圖2 各組海馬CA1區Beclin-1陽性細胞(免疫組織化學染色，bar=50 μm)

表3 各組術后不同時間海馬CA1區存活神經細胞數比較(/高倍視野)

表4 各組術后不同時間海馬CA1區Beclin-1蛋白陽性細胞數比較(/高倍視野)

圖3 各組海馬CA1區LC3-Ⅱ陽性細胞(免疫組織化學染色，bar=50 μm)

表5 各組術后不同時間海馬CA1區LC3-Ⅱ蛋白陽性細胞數比較(/高倍視野)

3 討論

鹽酸法舒地爾是一種新型抑制鈣離子、蛋白激酶、Rho激酶活性的異喹啉磺胺衍生物，具有很好的親水和親脂性。良好的親脂性使其易于通過血腦屏障，舒張顱內血管平滑肌，抑制血管痙攣，改善腦組織灌注，改善細胞的缺血缺氧，有效保護神經細胞[8-9]。文獻報道[10-11]，SAH可損傷大鼠海馬區神經細胞以及學習記憶功能。其作用機制可能是SAH后蛛網膜下腔間隙發生改變，激活Rho相關激酶，抑制肌球蛋白輕鏈的活性，導致肌球蛋白與肌動蛋白改變，引起顱內血管痙攣，腦組織缺血[12-14]。本研究顯示，SAH后，大鼠行為能力變差，海馬CA1區神經細胞形態改變明顯，存活率下降，與此前結果一致。

本研究選用自噬相關蛋白Belin-1和LC3-Ⅱ作為檢測自噬水平的標準，研究顯示，SAH組海馬CA1區自噬水平升高，藥物組自噬水平更高，提示鹽酸法舒地爾可明顯增強神經細胞自噬。

自噬是一種程序性死亡方式，是溶酶體分解代謝的過程。適度的自噬可以維持真核細胞、組織及機體的內環境平衡，保護細胞并減少細胞死亡；自噬受到抑制會影響細胞生存，對機體產生損害[15-16]。葉紅偉等[17]在大鼠心臟血管閉塞后給予法舒地爾干預，發現大鼠心肌細胞自噬明顯增多，起到保護性作用。Gao等[18]證實，法舒地爾可激活心肌H9c2細胞自噬而減少凋亡，這種作用可被自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤抑制，說明法舒地爾通過激活自噬發揮保護性作用。Zhao等[19]報道，應用自噬激活劑干預SAH大鼠，發現LC3-Ⅱ及Beclin-1表達增多，神經細胞凋亡明顯減少；用自噬抑制劑干預后，神經功能損害加重。

目前關于鹽酸法舒地爾對自噬影響的研究多集中于體外，體內研究較少，對于神經細胞的研究更少。本研究通過頸內動脈刺破法造模，對SAH大鼠進行體內試驗，研究結果與上述文獻報道一致。本研究未涉及具體作用機制，有待進一步研究。

綜上所述，鹽酸法舒地爾可能通過增強海馬CA1區自噬，減少神經細胞的損傷，改善大鼠學習記憶功能。

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Effects of Fasudil Hydrochloride on Learning and Memory Ability and Autophagy in CA1 Area of Hippocampus in Subarachnoid Hemorrhage Rats

SUN Lin-lin1,LIU Zhen-gang1,ZHANG Zhi-yong2,CHEN Yang2,LIU Jun-jie1,FU Ai-jun2,LI Jian-min2
1.North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China;2.Department of Neurosurgery,Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China

FU Ai-jun.E-mail:tsfaj@sina.com

ObjectiveTo investigate the effects of fasudil hydrochloride on learning and memory,and the autophagy in hippocampal CA1 neurons in subarachnoid hemorrhage(SAH)rats.MethodsFifty-four male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=18),SAH group(n=18)and drug group(n=18).Subarachnoid hemorrhage model was established with internal carotid artery puncture.The drug group was injected fasudil hydrochloride 10 mg/kg intraperitoneally after modeling per 24 hours,while the sham group and SAH group were injected the same volume of saline.They were tested with shuttle box test 6,24 and 72 hours after intervention,then the hippocampal CA1 area was stained with HE and immunohistochemistry to observe the morphology of cells and the expression of Beclin-1 and microtubule-associated protein 1 light chain 3 II(LC3-II).ResultsCompared with the sham group,the frequence of avoidance decreased in SAH group at each time point(P<0.05),while the avoidance reaction time increased(P<0.05);the survival of neurons in hippocampal CA1 area decreased(P<0.05),and the expression of Beclin-1 and LC3-II increased(P<0.05).Compared with SAH group,the frequence of avoidance increased in the drug group at each time point(P<0.05),while the avoidance reaction time decreased(P<0.05);the survival of neurons in hippocampal CA1 area increased(P<0.05)and the expression of Beclin-1 and LC3-II increased further(P<0.05).ConclusionFasudil hydrochloride can improve learning and memory ability and protect neurons from damage,which may associate with the excess of autophagy activation in hippocampal CA1 areas in SAH rats.

subarachnoid hemorrhage;fasudil hydrochloride;learning and memory;autophagy;rats

R743.35

A

1006-9771(2017)03-0257-06

2016-12-11

2017-01-16)

河北省重大醫學課題(No.ZD2013093)。

1.華北理工大學，河北唐山市063000；2.華北理工大學附屬醫院神經外科，河北唐山市063000。作者簡介：孫林林(1989-)，男，漢族，河南商丘市人，碩士研究生，醫師，主要研究方向：腦血管病。通訊作者：付愛軍，男，碩士，主任醫師，主要研究方向：腦血管病。E-mail:tsfaj@sina.com。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.03.003