人顳葉內側癲癇海馬組織星形膠質細胞Syntrophin的表達變化

王曉璇，孫振榮，吳敏，師忠芳，閆旭，徐立新，董麗萍，楊少華，袁芳

人顳葉內側癲癇海馬組織星形膠質細胞Syntrophin的表達變化

王曉璇1，孫振榮2，吳敏1，師忠芳1，閆旭1，徐立新1，董麗萍1，楊少華3，袁芳1

目的觀察人顳葉內側癲癇(MTLE)海馬組織星形膠質細胞syntrophin的表達變化。方法2015年4月至2016年7月，17例癲癇患者手術切除的海馬組織，依據蘇木素-伊紅(HE)染色及膠質原纖維酸性蛋白、神經元核抗原免疫組織化學染色結果，分為MTLE組13例和非MTLE組4例。免疫熒光雙重組織化學法及免疫熒光組織化學法觀察syntrophin的表達。結果MTLE組星形膠質細胞大量增生，神經元明顯減少。syntrophin在星形膠質細胞膜及足突處表達。與非MTLE組相比，MTLE組syntrophin在血管周圍星形膠質細胞足突處分布減少，在其他部位分布增加。圖像分析顯示，與非MTLE組相比，MTLE組syntrophin蛋白量顯著增多(t=5.421,P<0.001)。結論海馬組織syntrophin在星形膠質細胞上的分布及其整體表達變化可能與MTLE發生相關。

顳葉內側癲癇；海馬；星形膠質細胞；syntrophin；抗肌萎縮蛋白糖蛋白復合物

[本文著錄格式]王曉璇，孫振榮，吳敏，等.人顳葉內側癲癇海馬組織星形膠質細胞Syntrophin的表達變化[J].中國康復理論與實踐,2017,23(3):292-297.

CITED AS:Wang XX,Sun ZR,Wu M,et al.Distribution of astrocytic syntrophin in hippocampus from human mesial temporal lobe epilepsy[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(3):292-297.

syntrophin是抗肌萎縮蛋白糖蛋白復合物(dystrophin-associated glycoprotein complex,DGC)中的一個亞單位，主要起錨定蛋白的作用[1]。研究提示，水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)和內向整流性鉀離子通道

4.1(inward rectifier potassium channel 4.1,Kir4.1)通過syntrophin錨定到星形膠質細胞上[2-3]。我們以前的研究發現，星形膠質細胞上的AQP4和Kir4.1與顳葉內側癲癇(medial temporal lobe epilepsy,MTLE)的發生有密切關系[4]。動物實驗發現，敲除α-syntrophin基因的小鼠驚厥易感性增加，提示syntrophin可能參與癲癇的發生[5]。MTLE是難治性癲癇中最常見的類型，臨床常采用切除硬化海馬來控制癲癇發作[6]。本研究觀察手術切除MTLE及非MTLE患者海馬組織，運用免疫熒光染色技術觀察syntrophin的分布及表達情況，探討syntrophin參與MTLE發生的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗樣本

收集2015年4月至2016年7月首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科行顳葉切除術治療癲癇患者的海馬組織，切除的海馬組織即刻置4%多聚甲醛中固定以備病理檢查及后續實驗。

本方案已通過首都醫科大學附屬北京天壇醫院醫學倫理委員會審批。

1.2實驗試劑及器材

伊紅(ZLI-9613)、蘇木素(ZLI-9610)、羅丹明標記山羊抗兔熒光二抗(ZF-0316)、Alexa Fluor 488標記山羊抗小鼠熒光二抗(ZF-0512)、抗熒光淬滅封片劑(ZLI-9556)：北京中杉金橋生物技術有限公司。膠質原纖維酸性蛋白抗體(glial fibrillary acidic protein, GFAP,Z0334)、Envision檢測試劑盒(A-K5007)：丹麥DAKO公司。神經元核抗原抗體(neuronal nuclei, NeuN,ab177487)：美國ABCAM公司。syntrophin抗體(MAB2277)：美國MILLIPORE公司。正置熒光顯微鏡(Axio ImageryA2)：德國ZEISS公司。

1.3方法

1.3.1海馬組織學觀察及分組

海馬組織常規固定、包埋、切片厚4 μm，蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色及GFAP、NeuN免疫組織化學染色后，光學顯微鏡下觀察。

GFAP、NeuN免疫組織化學染色參考文獻二步法進行[7]。GFAP及NeuN抗體1∶2000稀釋，4℃孵育過夜，A-K5007試劑盒(Envision,DAKO)顯色。陰性對照用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)代替一抗，其余步驟相同。陽性細胞染色為淺至棕褐色。

MTLE海馬硬化診斷標準為海馬組織神經元丟失>50%及大量星形膠質細胞增生；非MTLE診斷標準為海馬組織表現為輕度神經元丟失(<25%)及少量星形膠質細胞增生，存在海馬結構附近腦組織病變[4,8]。

1.3.2免疫熒光雙重組織化學染色

采用syntrophin與GFAP免疫熒光雙重組織化學染色法觀察syntrophin在星形膠質細胞上的表達。染色方法參考文獻[7]。0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)微波熱修復，山羊血清封閉，滴加syntrophin抗體(1∶100)及GFAP抗體(1∶400)。4℃孵育過夜。滴加羅丹明標記的山羊抗兔熒光二抗(1∶200)及Alexa Fluor 488標記的山羊抗小鼠熒光二抗(1∶200)，室溫孵育1 h，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)室溫孵育5 min，PBS洗滌，抗熒光淬滅封片劑封片。正置熒光顯微鏡觀察、拍照。陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟相同。

1.3.3免疫熒光組織化學染色

滴加syntrophin一抗(1∶100)，4℃孵育過夜；滴加Alexa Fluor 488標記的山羊抗小鼠二抗(1∶200)，余同免疫熒光雙重組織化學染色。

應用Image J圖像分析軟件對syntrophin免疫熒光結果進行分析。每個標本取1張切片，鏡下(400×)隨機選取CA4區5個視野，圖片黑白反向處理，計算5個視野中平均光密度值(average optical density,AOD)。

1.4統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。對年齡、病程及syntrophin表達量以(±s)表示，進行t檢驗。對性別以例數表示，進行χ2檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1分組結果

共觀察17例結構比較完整的海馬組織標本。依據HE染色及GFAP、NeuN免疫組織化學染色(圖1)，MTLE組13例，非MTLE組4例。兩組間性別、年齡及病程均無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2免疫熒光雙重染色

非MTLE組syntrophin和GFAP在星形膠質細胞足突及胞膜上共表達，MTLE組syntrophin和GFAP在血管周圍星形膠質細胞足突上表達減少，在星形膠質細胞胞體上表達增多(圖2)。

2.3免疫熒光組織化學染色

MTLE組syntrophin陽性染色明顯增強(圖3)。圖像分析顯示，MTLE組syntrophin蛋白表達量顯著增加(t=5.421,P=0.0004)。

圖1 海馬組織HE染色、GFAP和NeuN免疫組化染色(bar=20 μm)

圖2 海馬組織syntrophin與GFAP免疫雙重熒光染色(bar=20 μm)

圖3 海馬組織syntrophin免疫熒光染色及統計結果

3 討論

目前國內外對syntrophin及DGC在癲癇疾病中的研究都十分有限。本研究顯示，syntrophin在MTLE患者海馬區明顯增多，且在星形膠質細胞上極性分布異常，即血管周圍星形膠質細胞足突處分布減少且星形膠質細胞胞體分布增加，提示syntrophin蛋白在MTLE的發生過程中起重要作用。

MTLE的發生歸因于神經元異常放電，但臨床發現MTLE患者普遍對抗癲癇藥物耐藥，且組織學觀察到神經元顯著丟失及星形膠質細胞大量增生。

星形膠質細胞在癲癇中的作用逐漸受到重視[9-10]。研究發現，星形膠質細胞通過調節細胞外K+及神經遞質的濃度參與癲癇的發生，這一調節作用主要依賴星形膠質細胞上的一些胞膜蛋白[11]。

DGC是一組跨膜蛋白復合物，主要由抗肌萎縮蛋白(dystrophin)、肌營養不良糖蛋白(dystroglycans)、肌聚糖蛋白(sarcoglycans)和syntrophin組成，在肌肉中主要起維持肌纖維結構和鈣穩態的作用[12]。研究發現，DGC在中樞神經系統也起著重要作用[13-14]。早期研究發現，DGC在Duchenne型肌營養不良癥(Duchenne muscular dystrophy,DMD)、Becker肌營養不良癥(Becker muscular dystrophy,BMD)等肌肉相關疾病中存在異常[15-16]；同時，許多DMD患者伴有認知障礙、學習障礙及神經精神異常等[17-18]。

已有研究證實，腦內DGC主要分布在神經元突觸后膜及星形膠質細胞上，主要起連接細胞外基質和細胞內骨架蛋白的作用[19]。神經元中DGC主要由β-dystrobrevin、α/β-dystroglycan、syntrophin、dystrophin和sarcoglycans組成，星形膠質細胞上DGC主要由 α-dystrobrevin、α/β-dystroglycan、syntrophin和DP71組成[20]。

DGC中的主要成分syntrophin作為接頭蛋白，由α、β1、β2、γ1、γ2五種亞基構成，每個亞基含有PDZ結構域及C端區域兩個同源結構域，不同的亞基連接不同的蛋白[21]。在星形膠質細胞中，syntrophin主要以α及γ亞基的形式存在，將AQP4、Kir4.1錨定到細胞膜上。AQP4是中樞神經系統分布最廣泛的水通道蛋白，起著跨膜轉運水分子以維持細胞內外水代謝平衡的作用[22]。Kir4.1在中樞神經系統中主要起調節神經元膜電位和星形膠質細胞的K+緩沖作用，維持細胞內外K+平衡[23]。

本研究顯示，海馬組織中syntrophin在星形膠質細胞胞膜及足突處表達，但是MTLE患者中syntrophin該處表達明顯減少，而在胞體處明顯增加，整體表達量增加。此種分布及表達變化與我們以往對AQP4和Kir4.1的研究相同[4]。

動物實驗證實，syntrophin敲除小鼠通過影響細胞外水分子和K+的平衡，參與疾病發生[24]。Heuser等[25]在MTLE中發現DGC中dystrophin和syntrophin的異常，且與Kir4.1丟失密切相關。我們推測，syntrophin在星形膠質細胞上的再分布與整體表達的增加，導致AQP4和Kir4.1再分布，加劇星形膠質細胞腫脹、細胞外間隙容積減少及細胞外K+濃度增加，參與癲癇發生。后續研究我們將進一步探究MTLE中syntrophin與AQP4/Kir4.1變化的關系。

綜上所述，本研究發現，海馬組織星形膠質細胞中syntrophin在細胞膜及足突處表達，MTLE患者syntrophin在血管周圍星形膠質細胞足突處表達明顯減少，胞體處表達增加，整體表達量增加。syntrophin可能通過改變錨定在其上的AQP4及Kir4.1的分布及表達，參與癲癇發作。本研究為星形膠質細胞參與MTLE的可能分子機制提供了新的線索及思路。

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Distribution ofAstrocytic Syntrophin in Hippocampus from Human Mesial Temporal Lobe Epilepsy

WANG Xiao-xuan1,SUN Zhen-rong2,WU Min1,SHI Zhong-fang1,YAN Xu1,XU Li-xin1,DONG Li-ping1,YANG Shao-hua3,YUAN Fang1
1.Department of Pathophysiology,Beijing Neurosurgical Institute,Beijing Tiantan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050,China;2.Department of Neurosurgery,Beijing Tiantan Hospital,Capital Medical University, Beijing 100050,China;3.Department of Pharmacology and Neuroscience,University of North Texas Health Science Center,Fort Worth,Texas 76107,USA

YUAN Fang and SUN Zhen-rong.E-mail:florayuan@vip.sina.com(YUAN Fang),sunzr1961@ 163.com(SUN Zhen-rong)

ObjectiveTo investigate the expression changes of astrocytic syntrophin in hippocampus from human mesial temporal lobe epilepsy(MTLE).MethodsFrom April,2015 to July,2016,17 cases of hippocampus,collected from temporal lobectomy,were divided into MTLE group(n=13)and non-MTLE group(n=4)according to hematoxylin and eosin staining,glial fibrillary acidic protein and neuronal nuclei immunohistochemical staining.Immunofluorescence double labeling and immunofluorescence histochemistry were used to observe the expression of syntrophin.ResultsThe proliferation of astrocytes increased and neurons reduced in the hippocampus of MTLE group.Syntrophin was found in the membrane and foot processes of astrocyte,that was enriched along perivascular astrocyte end-feet domain in non-MTLE group,but lost in MTLE group.While the whole expression of syntrophin was more in MTLE group than in non-MTLE group (t=5.421,P<0.001).ConclusionThe distribution of syntrophin in hippocampus astrocytes may be related to the development of MTLE.

mesial temporal lobe epilepsy;hippocampus;astrocyte;syntrophin;dystrophin-associated glycoprotein complex

R742.1

A

1006-9771(2017)03-0292-06

2016-12-21

2017-01-13)

北京市自然科學基金項目(No.7152027)。

1.首都醫科大學北京市神經外科研究所病理生理室，首都醫科大學附屬北京天壇醫院，北京市100050；2.首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科，北京市100050；3.北德克薩斯大學醫學中心神經與藥理系，美國德克薩斯州沃思堡76107。作者簡介：王曉璇(1993-)，女，漢族，山東聊城市人，碩士研究生，主要研究方向：難治性癲癇的發病機制研究。通訊作者：袁芳、孫振榮。E-mail:florayuan@vip.sina.com(袁芳)、sunzr1961@163.com(孫振榮)。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.03.009