紫鉚因改善化療損傷卵巢功能的研究

張瓊　梁宗文　張安琪　盧曉聲　朱望愛　胡越

[摘要] 目的 探討紫鉚因對化療所誘導大鼠卵巢功能損害的改善作用及其可能的作用機制。 方法 選擇雌性Wistar大鼠隨機分為對照組、化療組、聯合治療組（環磷酰胺+紫鉚因）和紫鉚因組，每5天測重；蘇木精-伊紅染色觀察卵泡發育和各級卵泡計數；Elisa法檢測雌激素、孕激素水平；Western blot 檢測Sirt1和Cleaved Caspase 3 蛋白表達水平。 結果 化療組大鼠體重、卵巢質量明顯小于對照組，聯合治療組則明顯高于化療組。化療組大鼠動情周期紊亂，聯合治療組陰道細胞涂片表現為規律的動情周期。化療組卵巢結構破壞，始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡和竇狀卵泡均少于其他三組。聯合治療組血清E2水平顯著高于化療組，FSH水平顯著低于化療組。Western blot結果顯示化療組Sirt1蛋白水平低于對照組，Cleaved Caspase 3蛋白水平高于對照組，相反，聯合治療組的Sirt1蛋白水平高于化療組，Cleaved Caspase 3蛋白水平低于化療組。 結論 紫鉚因可以改善化療對大鼠卵巢功能的損害，其作用機制可能與上調Sirt1抑制細胞凋亡相關。

[關鍵詞] 紫鉚因；化療；卵巢；Sirt1；凋亡

[中圖分類號] R711.75 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）34-0035-05

Study on the effect of butein on the improvement of impaired ovarian function induced by chemotherapy

ZHANG Qiong LIANG Zongwen ZHANG Anqi LU Xiaosheng ZHU Wangai HU Yue

Department of Gynecology and Obstetrics， the Second Affiliated Hospital and Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of butein on the improvement of impaired ovarian function induced by chemotherapy in rats and its possible mechanism. Methods Female Wistar rats were randomly divided into control group， chemotherapy group， combined treatment group （cyclophosphamide+butein） and butein group. They were weighed every 5 days； the development of follicles and the count of follicles at all levels were observed by hematoxylin-eosin staining method. The levels of estrogen and progesterone were detected by Elisa method. Western blot was used to detect the expression level of Sirt1 and Cleaved Caspase 3. Results Rats' weight and ovary weight in the chemotherapy group were significantly lower than that in the control group， and the combined treatment group was significantly higher than that in the chemotherapy group； in the chemotherapy group， the estrous cycle of rats was disordered， and the vaginal smear in the combined treatment group showed regular estrous cycle； in the chemotherapy group， the structure of ovary was destroyed， and primordial follicles， primary follicles， secondary follicles and antral follicles were less than those in the other three groups； the level of serum estradiol was significantly higher in the combined treatment group than that in the chemotherapy group， and the level of FSH was significantly lower than that in the chemotherapy group； Western blot analysis showed that the level of Sirt1 protein in the chemotherapy group was lower than that in the control group， and Cleaved Caspase 3 protein level was higher than that in the control group. In contrast， the Sirt1 protein level in the combined treatment group was higher than that in the chemotherapy group， while the Cleaved Caspase 3 protein level was lower than that in the control group. Conclusion Butein can improve the impaired ovarian function induced by chemotherapy； the mechanism may be related to the up-regulation of Sirt1 on the inhibition of cell apoptosis.

[Key words] Butein； Chemotherapy； Ovary； Sirt1； Apoptosis

在女性生殖系統中，卵巢對化療藥物最敏感[1]，化療藥物在提高腫瘤和免疫性疾病治愈率的同時，會引起卵巢功能障礙、卵巢早衰甚至導致不孕不育，嚴重影響年輕婦女的生活質量和自信心[2]。因此，如何在使用化療藥物的同時保護女性的卵巢功能有巨大的醫學需求。細胞凋亡被認為是化療藥物引起卵巢的結構及功能破壞從而導致卵泡丟失的機制之一[3]。據報道，Sirtuin在維持卵巢功能中起重要作用[4]。其中Sirtuin家族中的Sirt1，被稱為是壽命延長的關鍵因子，是一種去乙酰化酶，能夠將FOXO（forkhead box class O）去乙酰化從而抑制細胞凋亡[5]，而紫鉚因是Sirt1的激活劑[6]，由此推測紫鉚因是否能通過上調Sirt1而抑制卵巢顆粒細胞的凋亡，從而對化療損傷卵巢功能起到保護作用。

目前國內外均未見紫鉚因與化療損傷卵巢功能的相關報道，本文旨在探討紫鉚因預防性應用對化療后卵巢組織結構、卵巢內分泌功能、各級卵泡數量所起的一系列作用及機制，為臨床腫瘤治療和免疫性疾病中應用大劑量的化療藥物后卵巢功能保護的藥物開發提供有實用價值的科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

紫鉚因（TCI公司，日本）、環磷酰胺（恒瑞醫藥股份有限公司，中國；國藥準字H32020857，0.2 g）、兔抗Sirt1抗體（Cell Signaling公司，美國）、兔抗Cleaved-Caspase 3抗體（Cell Signaling公司，美國）、羊抗兔二抗（ICLlab公司，美國）、BCA試劑盒（Thermo公司，美國）、大鼠FSH、E2 Elisa盒（南京建成生物工程研究所，中國）。

1.2 實驗動物

健康成年雌性清潔級Wistar大鼠[北京維通利華實驗動物中心提供，SCXK（京）2011-0011]60只，體重250～280 g，標準條件（22℃～25℃，12 h照明）下飼養，自由取水。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組 取2月齡雌性Wistar大鼠60只，經陰道涂片確認有正常性周期后開始實驗。隨機分為4組，對照組：不加任何處理；化療組：建模后不做其他處理；聯合治療組：建模同時喂服紫鉚因5 mg/kg 45 d；紫鉚因組：不建模同期喂服紫鉚因45 d。

1.3.2 建模 在體外建立化療性卵巢早衰的大鼠模型，采用環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）腹腔注射建模，負荷劑量為50 mg/kg，之后按8 mg/kg的劑量連續腹腔注射14 d[7]。

1.3.3 觀察指標 觀察大鼠體重、動情周期及卵巢大體情況，在建模前及建模起每天陰道涂片觀察大鼠動情周期，每5天監測大鼠體重，并于建模后45 d處死大鼠，取出雙側卵巢，觀察大體外觀變化及稱重。

1.3.4 檢測大鼠卵巢的病理改變 將實驗所得大鼠一側卵巢HE染色切片，觀察組織形態學變化和卵泡計數。計算方法：計數每張卵巢組織切片上不同階段的卵泡個數。卵泡的組織學分類[8]：始基卵泡：單個卵母細胞被扁平的前顆粒細胞部分或完全圍繞；初級卵泡：單個卵母細胞被單層立方形的顆粒細胞包圍，外周繞以一層扁平卵泡膜細胞；次級卵泡：單個卵母細胞被一層以上顆粒細胞包繞，未出現卵泡腔；竇狀卵泡：存在卵泡腔并可見卵丘顆粒細胞。

1.3.5 血清雌二醇、卵泡刺激素濃度檢測 在建模前及建模完成后第1、15、30、45天剪尾取血通過Elisa法檢測雌二醇（estradiol，E2）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）水平的變化。

1.3.6 Western blot分析 實驗所得大鼠另一側卵巢在-80℃冰箱保存，用于Western blot分析。常規方法提取卵巢組織總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移至硝酸纖維（NC） 膜上，用質量分數為5%的BSA/脫脂牛奶封閉NC 膜1 h，加入一抗[Sirt1、Cleaved Caspase 3或β-actin（抗體）∶V（TBS）=1∶1000稀釋于TBS中] 4℃過夜；洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG 二抗（1∶2000稀釋），室溫下緩慢振蕩2 h；最后用化學發光試劑盒顯色、曝光，用圖像分析軟件對蛋白條帶作灰度掃描分析，β-actin 作為內參。

1.4統計學處理

采用SPSS16.0統計分析軟件，計量資料以均數±標準差表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，組間比較采用Tukey檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組大鼠體重和動情周期變化比較

為評估化療及紫鉚因對大鼠體重的影響，每5天測量大鼠體重1次并記錄。實驗前各組大鼠體重無統計學差異。實驗過程中對照組平均體重逐漸緩慢升高，由建模前的（277.0±2.6）g增加到第45天的（309.0±1.0）g；化療組在建模階段體重呈進行性下降，由建模前的（276.3±3.2）g降至第15天的（260.0±3.0）g，之后逐漸緩慢升高，第45天體重為（283.7±3.5）g，較對照組顯著降低（P<0.05）；聯合治療組第45天體重為（300.5±1.2）g，顯著高于化療組（P<0.05）（表1）。

正常大鼠動情周期4～5 d，其中動情前期17～21 h，動情期9～15 h，動情后期10～14 h和動情間期60～70 h[9]。對照組和聯合治療組大鼠在整個觀察期監測陰道脫落細胞涂片可見正常的動情周期，仍然存在動情前期、動情期、動情后期及動情間期4個明顯時期；化療組大鼠可見動情周期紊亂，動情期縮短甚至消失，為持續性的動情間期。

2.2四組大鼠卵泡數量、卵巢質量及卵巢組織形態學改變比較

各組大鼠在喂養45 d后，取大鼠雙側卵巢并稱重。結果顯示，化療組大鼠卵巢平均質量顯著小于對照組（P<0.05），而聯合治療組卵巢質量較化療組顯著增加（P<0.05）（表2），紫鉚因組與對照組相比無顯著差異。

在第45天處死大鼠的卵巢中，對照組可見各級正常卵泡，且始基卵泡、初級卵泡多見，顆粒細胞多且排列整齊；化療組卵巢結構破壞，始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡和竇狀卵泡均少于其他三組，差異有統計學意義（P<0.05），可見大量閉鎖卵泡，顆粒細胞黃素化、排列紊亂；聯合治療組及紫鉚因組可見各級正常卵泡，閉鎖卵泡少（表2、圖1）。

2.3 四組大鼠血清雌二醇（E2）和卵泡刺激素（FSH）濃度比較

本研究測定的大鼠動情間期的血清E2和FSH水平相當于基礎的E2和FSH水平。給藥前，各組血清E2和FSH水平無統計學差異（P>0.05）。

給藥期間，對照組和紫鉚因組E2水平呈正常波動，化療組大鼠的血清E2于第15天時明顯下降，此后再波動，第45天顯著低于對照組（P<0.05）；聯合治療組大鼠的血清E2于第15天低于對照組，但顯著高于化療組（P<0.05），此后逐漸回歸，第45天E2值與對照組無差異（表3）。

給藥期間，對照組和紫鉚因組FSH水平呈正常波動，化療組大鼠的血清FSH于第15天時達最高峰，顯著高于對照組（P<0.05），此后在高水平波動，第45天仍顯著高于對照組（P<0.05）；聯合治療組大鼠的血清FSH顯著低于化療組（P<0.05）（表4）。

2.4 Sirt1和Cleaved Caspase 3 蛋白在大鼠卵巢組織中的表達水平

Western blot檢測結果顯示（圖2、表5），各實驗組Sirt1蛋白和Cleaved Caspase 3蛋白表達水平存在顯著差異（F=345.0，P<0.05；F=98.7，P<0.05）。化療組大鼠卵巢Sirt1蛋白表達水平顯著低于對照組（P<0.05），聯合治療組及紫鉚因組Sirt1蛋白表達水平顯著高于對照組及化療組（P<0.05）。化療組大鼠卵巢Cleaved Caspase 3蛋白表達水平顯著高于對照組和聯合治療組（P<0.05）。

3討論

化療藥物的應用使得各種腫瘤和免疫性疾病治愈率得到提高的同時，所帶來的并發癥越來越多，因此受到臨床醫師的重視。卵巢作為化療藥物毒性作用的一個特殊靶器官，暴露于必須的化療可使卵巢功能遭到不同程度損害，出現月經失調、輕重不等的卵巢功能衰竭，甚至導致不孕不育，嚴重影響年輕婦女的生活質量和自信心[10]。研究顯示，64%的成年女性患者經歷腫瘤治療后伴隨至少一項卵巢功能衰竭的癥狀[11]。因此，探尋化療對卵巢功能損害的對策成為近年的研究熱點，如促性腺激素釋放激素類似物（Gonadotropin-releasing-hormone analogues，GnRHa）的應用[12，13]，但費用高昂；還有學者提出組織冷凍保存-自體移植（Cryopreservation-autotransplantation）方面[14]，組織冷凍保存-自體移植存在技術性、安全性，甚至倫理性問題需要進一步解決，適用范疇較為局限，目前尚未臨床推廣應用，故尋找一種安全有效的方法使化療藥物的卵巢損傷降到最低成為當務之急。

紫鉚因主要從腰果樹、降香黃檀和漆樹中提取，是一種查爾酮類物，對機體抗氧化、抗炎癥及抗新生血管活性等多個方面起重要調節作用[15，16]。但紫鉚因對卵巢功能的作用，尤其對化療損傷卵巢功能的影響并未有報道。有學者認為化療對卵巢功能的損傷主要反映在卵巢儲備功能的下降，而反映卵巢儲備功能的直接指標是卵泡的數量，間接指標有基礎FSH和E2。本研究以客觀指標證實紫鉚因能有效改善化療所致的卵巢功能下降并闡明其作用機制。

3.1 紫鉚因干預化療對卵巢重量及卵泡數量的影響

有研究對化療患者的卵巢組織取活檢后發現卵巢萎縮、體積變小，卵巢的各級卵泡數均減少，特別是初級和次級生長卵泡的減少最明顯，甚至出現無卵泡卵巢[17]。本實驗結果發現與對照組相比，化療組的卵巢重量、始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡和竇狀卵泡均減少，可見大量閉鎖卵泡，顆粒細胞黃素化、排列紊亂，表明化療可導致卵巢結構破壞，引起卵巢早衰。相反，化療聯合紫鉚因聯合治療組可見各級正常卵泡，且始基卵泡、初級卵泡多見，顆粒細胞多且排列整齊，推測紫鉚因可改善化療對卵巢大體和結構的損傷。

3.2 紫鉚因干預化療對卵巢內分泌功能損害的作用

化療藥物致女性性腺功能破壞的常見結局是卵巢早衰，性激素水平的結果常見有FSH顯著升高，E2水平低下[18]。本實驗結果顯示化療組血清E2顯著低于對照組和聯合治療組，血清FSH顯著高于對照組和聯合治療組，提示化療對卵巢內分泌功能有一定的損害作用，而紫鉚因干預能減少化療所導致的卵巢內分泌功能的損害，究其原因可能是化療藥物破壞卵泡正常結構、減少卵泡數量，使性激素分泌減少，繼而反饋性引起促性腺激素釋放激素的分泌增加，而紫鉚因干預能保存卵泡正常結構，改善受損的卵巢功能，恢復正常性激素分泌。

3.3 紫鉚因改善化療損傷卵巢功能的作用機制

卵巢顆粒細胞包繞著卵母細胞，在卵泡發育過程中起著支持、營養卵母細胞的功能，從而確保卵泡發育、排卵、卵子受精和胚胎發育。化療導致卵巢功能損傷的主導途徑可能是啟動了細胞凋亡[19]。研究證實早期卵泡的卵細胞發生凋亡，從而導致卵泡閉鎖和丟失；晚期生長卵泡由于顆粒細胞凋亡而發生卵泡閉鎖。受化療藥物影響，卵泡內的一些特定的信號被激活而促使細胞發生凋亡，抑制此過程就有可能抑制凋亡，從而保護卵巢功能，這為保護女性腫瘤患者化療后卵巢功能和生殖能力提供了新的途徑。

本研究觀察成年雌性大鼠在化療和紫鉚因干預下卵巢Sirt1 及促凋亡蛋白Cleaved Caspase 3的表達水平。結果顯示，化療組Sirt1蛋白的表達相對于對照組明顯降低，而聯合紫鉚因治療組Sirt1蛋白水平比對照組顯著增高。既往研究提示，紫鉚因是Sirt1的激活劑[6]，而Sirt1是壽命延長效應的關鍵因子。對Sirt1轉基因小鼠研究發現其性成熟延遲而Sirt1基因缺陷小鼠不能生育[20]。由此可見Sirt1對卵巢功能有著重要作用。與對照組相比，化療組的卵巢Cleaved Caspase 3蛋白表達明顯增高，表明化療對卵巢功能的損傷；而化療聯合紫鉚因治療能顯著下調Cleaved Caspase 3 蛋白表達，起到調控卵巢顆粒細胞凋亡的作用。本研究結果顯示，Sirt1能抑制卵巢顆粒細胞的凋亡。因此推測，紫鉚因可能通過激活Sirt1，抑制細胞凋亡，從而實現對化療損傷卵巢功能的改善。

綜上所述，紫鉚因可以改善化療對大鼠卵巢功能的損害，其作用機制可能與激活Sirt1、增加Sirt1表達、抑制細胞凋亡、維持卵泡池儲備相關。本研究為臨床腫瘤治療和免疫性疾病中應用大劑量化療藥物后卵巢功能保護的藥物開發提供新的思路。

[參考文獻]

[1] Bedoschi G，Navarro PA，Oktay K. Chemotherapy-induced damage to ovary：Mechanisms and clinical impact[J]. Future Oncology，2016，12（19）：2333-2344.

[2] Champagne C，Taylor M，Farrant P. Permanent chemotherapy-induced nonscarring alopecia and premature ovarian failure[J]. Clinical and Experimental Dermatology，2015，40（5）：589-590.

[3] Morgan S，Anderson RA，Gourley C，et al. How do chemo- therapeutic agents damage the ovary？[J]. Ham Reprod Update，2012，18（5）：525-535.

[4] Zhang X，Li L，Xu J，et al. Rapamycin preserves the follicle pool reserve and prolongs the ovarian lifespan of female rats via modulating mTOR activation and sirtuin expression[J]. Gene，2013，523（1）：82-87.

[5] Michan S，Sinclair D. Sirtuins in mammals：Insights into their biological function[J]. Biochem J，2007，404（1）：1-13.

[6] Yang J，Kong X，Martins-Santos ME，et al. Activation of SIRT1 by resveratrol represses transcription of the gene for the cytosolic form of phosphoenolpyruvate carboxykinase（GTP） by deacetylating hepatic nuclear factor 4alpha[J].Journal of Biological Chemistry，2009，284（40）：27042-27053.

[7] Fu X，He Y，Xie C，et al. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation improves ovarian function and structure in rats with chemotherapy-induced ovarian damage[J].Cytotherapy，2008，10（4）：353-363.

[8] 謝幸，茍文麗. 婦產科學[M]. 第8版，北京：人民衛生出版社，2014：1.

[9] 陳亮. 一種新的評估大鼠孕齡的方法[D]. 南京大學，2012.

[10] Long JP，Wan F，Zhang F，et al. DTC chemotherapy regimen is associated with higher incidence of premature ovarian failure in women of reproductive age with breast cancer[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2016，20（6）：1087-1092.

[11] Bines J，Oleske DM，Cobleigh MA. Ovarian function in premenopausal women treated with adjuvant chemotherapy for breast cancer[J]. Journal of Clinical Oncology，1996， 14（5）：1718-1729.

[12] Blumenfeld Z，Zur H，Dann EJ. Gonadotropin-releasing hormone agonist cotreatment during chemotherapy may increase pregnancy rate in survivors[J]. Oncologist，2015， 20（11）：1283-1289.

[13] Blumenfeld Z. Endocrine prevention of chemotherapy-induced ovarian failure[J]. Future Oncology，2016，12（14）：1671-1674.

[14] Schmidt KT，Rosendahl M，Ernst E，et al. Autotransplantation of cryopreserved ovarian tissue in 12 women with chemotherapy-induced premature ovarian failure：The Danish experience[J]. Fertility & Sterility，2011，95（2）：695-701.

[15] Zhang L， Yang X， Li XU，et al. Butein sensitizes HeLa cells to cisplatin through the AKT and ERK/p38 MAPK pathways by targeting FoxO3a[J]. International Journal of Molecular Medicine，2015，36（4）：957-966.

[16] Seo WY，Youn GS，Choi SY，et al. Butein，a tetrahydroxychalcone，suppresses pro-inflammatory responses in HaCaT keratinocytes[J]. Bmb Reports，2015，48（9）：495-500.

[17] 徐安然，鄧曉惠. 放化療致卵巢損害的機制及其組織學改變[J]. 國際生殖健康/計劃生育雜志，2006，25（6）：333-336.

[18] Qin JJ，Rui-Man LI，Qian WU. Effects of different prescriptions for reinforcing kidney on chemotherapy-induced premature ovarian failure[J]. Chinese Journal of Pathophysiology， 2012，28（10）：1847-1850.

[19] Falcone T，Moore HC. GnRH agonist for gonadal protection during chemotherapy[J]. Human Reproduction，2015， 30（12）：2711-2712.

[20] Laura Bordone，Cohen D，Ashley Robinson，et al. SIRT1 transgenic mice show phenotypes resembling calorie restriction[J]. Aging Cell，2007，6（6）：759-767.

（收稿日期：2016-09-16）