深海獨島枝芽胞桿菌1A00493殺根結線蟲活性物質研究

鄭 娜，黃 典，邵宗澤，喻子牛，張吉斌*

(1.農業微生物學國家重點實驗室 華中農業大學生命科學技術學院 微生物農藥國家工程研究中心，湖北 武漢430070；2.國家海洋局第三海洋研究所 海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門 361005)

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深海獨島枝芽胞桿菌1A00493殺根結線蟲活性物質研究

鄭 娜1，黃 典1，邵宗澤2，喻子牛1，張吉斌1*

(1.農業微生物學國家重點實驗室 華中農業大學生命科學技術學院 微生物農藥國家工程研究中心，湖北 武漢430070；2.國家海洋局第三海洋研究所 海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門 361005)

以一株具有殺南方根結線蟲(Meloidogyneincongnita)活性的深海獨島枝芽胞桿菌(Virgibacillusdokdonensis)1A00493為研究對象，對其發酵上清液的殺線蟲活性進行測定，并對殺線蟲活性物質進行理化分析。利用正相硅膠柱、反相硅膠柱、LH-20葡聚糖凝膠柱分離以及示差折光高效液相色譜(RID-HPLC)對活性物質進行分離純化，將純化的活性物質進行液相色譜-質譜聯用分析。結果表明，殺線蟲活性物質耐高溫、對蛋白酶和酸堿不敏感、硫酸銨沉淀物無殺線蟲活性、3 kDa超濾管濾過液有活性、易溶于甲醇和氯仿，推測活性物質是中強極性小分子物質。殺線蟲活性物質主要有3種化合物，其中分子量為234 Da的新型化合物很有可能是主要的活性物質。

深海獨島枝芽胞桿菌；根結線蟲；活性物質；分離純化

植物寄生線蟲主要生長在植物根際或者周圍土壤中，能夠和其它植物病原菌協同產生危害作用，其對農作物危害程度僅次于真菌，已超過細菌和病毒病害[1]，對農業生產造成重大損失。根結線蟲(Meloidogynespp.)是植物寄生線蟲中分布廣泛、種類較多、危害植物生長最為嚴重的種類之一[2-4]。在我國，對植物危害最大的是南方根結線蟲(Meloidogyneincongnita)，長期以來，我國對作物病原線蟲的防治主要依靠化學藥劑，但是，高毒性的化學藥劑在使用過程中會造成農產品和環境污染問題。因此，殺線蟲劑的應用應該向低毒、高效、低殘留方向發展[5]。目前國內外研究線蟲防治的主要趨勢是利用真菌、細菌、放線菌等其它微生物開發微生物制劑，逐漸由化學藥劑轉向生物防治，從而達到防治線蟲和消除化學藥劑對人類及環境危害的雙重作用[6]。

海洋環境獨特，如高鹽、高壓、低溫、少光、高pH值、寡營養等決定了海洋微生物獨特的生活方式、代謝途徑和防御系統，豐富的海洋微生物及其產生的代謝活性物質為開發海洋生物活性物質提供了豐富的資源[7]。從海洋微生物中篩選新型菌株，利用微生物菌劑或者提取的抗病害活性物質進行農業生物防治，能夠逐漸減緩或消除化學防治給環境和人類健康帶來的嚴重危害，這也是當前植物保護方向生物防治研究的重點與熱點。作者對一株分離自深海的獨島枝芽胞桿菌(Virgibacillusdokdonensis)1A00493的發酵上清液的代謝活性物質進行理化分析與分離純化，并進行活性物質結構鑒定與預測，為下一步開發菌株1A00493微生物制劑與微生物代謝物制作生物農藥的研究奠定基礎。

1 實驗

1.1 菌種與線蟲

獨島枝芽胞桿菌(Virgibacillusdokdonensis)1A00493，中國海洋微生物菌種保藏管理中心(CMCC)。

南方根結線蟲(Meloidogyneincongnita)由南京農業大學李紅梅教授提供。

1.2 儀器

真空旋轉蒸發儀，恒溫鼓風干燥箱，恒溫搖床，高速離心機，光學顯微鏡，倒置顯微鏡，真空冷凍干燥機，pH計，NH2色譜柱(250 mm×4.6 mm)，LC-20AT型液相色譜儀，RID-10A型示差折光檢測儀，Agilent 6540型液相色譜-質譜聯用儀。

1.3 培養基與人工海水配方

海洋細菌培養基(2216e)：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、牛肉浸粉1 g、乙酸鈉1 g、硝酸銨0.2 g、檸檬酸鈉0.5 g、檸檬酸鐵0.1 g、人工海水1 000 mL，pH值7.6±0.2。

人工海水：氯化鈉19.45 g、氯化鎂0.75 g、硫酸鎂0.75 g、氯化鈣1 g、氯化鉀0.55 g、碳酸氫鈉0.16 g、溴化鉀0.08 g、氯化鍶34 mg、硼酸22 mg、硅酸鈉4 mg、氟化鈉2.4 mg、磷酸氫二鈉8 mg、氯化錳0.5 mg、硫酸銅0.5 mg、硫酸鋅10 mg、蒸餾水1 000 mL。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化培養

用接種環從30%甘油保菌管中挑取少量菌液在2216e培養基上涂平板，置于28 ℃培養箱中培養72 h。挑取單菌落涂平板后置于28 ℃培養箱中培養48 h，按此方法活化3次后備用。

1.4.2 南方根結線蟲培養

將番茄種子滅菌處理，用70%酒精消毒1 min，2%次氯酸鈉消毒10 min，無菌水洗滌3次后置于吸滿水的濾紙上萌發。將萌發的種子種植在濕熱無菌的培養土(土∶沙=1∶1)中，每盆接種1顆番茄；長出4片子葉后再接種，接種時用玻璃棒在番茄苗的周圍均勻插3個小孔，把南方根結線蟲卵塊放入小孔中，然后覆蓋滅菌土。于溫室(控制室溫22 ℃左右)培養 45 d后小心拔出番茄植株，用清水將根部土壤洗凈，挑取根部的卵塊備用。每盆接種二齡線蟲約1 000頭。

1.4.3 殺線蟲活性測定

(1)取菌株1A00493發酵液原液及稀釋2倍、5倍的上清液用0.22μm濾膜過濾除菌2次，96孔平板中每孔加200μL上清液、約30條南方根結線蟲、4μL 1 mg·mL-1氯霉素，每種待測液做3個平行。以不加發酵液為對照，于20 ℃下培養，分別在24 h、36 h、48 h時于倒置顯微鏡下觀察，用針刺法判斷線蟲是否死亡，統計死亡線蟲數量。按下式計算線蟲死亡率、校正死亡率：

1.4.4 菌株發酵上清液殺線蟲活性物質理化性質研究

1.4.4.1 發酵時間對活性物質殺線蟲活性的影響

菌株的最適生長溫度為28 ℃，以1%接種量接種于培養基中，分別取培養12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h發酵液各1 mL測定殺線蟲活性，考察發酵時間對活性物質殺線蟲活性的影響。1.4.4.2 紫外照射時間對活性物質殺線蟲活性的影響將菌株1A00493發酵48 h，取無菌發酵上清液4份，每份10 mL盛入直徑為10 cm的滅菌玻璃平板中，分別于室溫25 ℃、254 nm紫外光下照射30 min、60 min、90 min和120 min，于室溫25 ℃下測定殺線蟲活性，以初始發酵上清液為對照，每個處理做3個平行，考察紫外照射時間對活性物質殺線蟲活性的影響。

1.4.4.3 溫度對活性物質殺線蟲活性的影響

將菌株1A00493發酵48 h，取無菌發酵上清液分別置于20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃和121 ℃環境中，30 min后取出冷卻，于室溫25 ℃下測定殺線蟲活性，以初始發酵上清液為對照，每個處理做3個平行，考察溫度對活性物質殺線蟲活性的影響。

1.4.4.4 pH值對活性物質殺線蟲活性的影響

將菌株1A00493發酵48 h，取無菌發酵上清液，用HCl或NaOH調pH值分別為3、5、7、9和11，室溫放置2 h，然后用HCl或NaOH調回到初始發酵上清液pH值(約為7.84)，于室溫25 ℃下測定殺線蟲活性，以初始發酵上清液為對照，每個處理做3個平行，考察pH值對活性物質殺線蟲活性的影響。

1.4.4.5 蛋白酶敏感性

將菌株1A00493發酵48 h，取無菌發酵上清液，用濃度為1 mg·mL-1的蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶分別處理發酵上清液3 h，于室溫25 ℃下測定殺線蟲活性。蛋白酶K在pH值8.0、40 ℃下處理；胰蛋白酶在pH值8.0、37 ℃下處理；胃蛋白酶在pH值4.5、37 ℃下處理。在室溫25 ℃下，以初始發酵上清液和濃度為1 mg·mL-1的蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶為對照，考察活性物質對蛋白酶的敏感性。

1.4.4.6 硫酸銨沉淀處理

采用梯度鹽析法，將菌株1A00493發酵上清液分別用0～20%、20%～40%、40%～60%、60%～80%和80%～100%硫酸銨濃度梯度以及用80%和100%硫酸銨沉淀蛋白，沉淀蛋白用PBS緩沖液溶解，于4 ℃透析24 h，過濾除菌，測定殺線蟲活性。

1.4.4.7 活性物質分子量大小

將菌株1A00493發酵48 h，取無菌發酵上清液5 mL，分別經過100 kDa、50 kDa、10 kDa、3 kDa超濾管，取截留液及濾過液分別在室溫25 ℃下測定殺線蟲活性，以初始發酵上清液為對照，判斷活性物質分子量范圍。

1.4.4.8 活性物質有機溶劑萃取實驗

將菌株1A00493發酵48 h，取無菌發酵上清液5份，每份50 mL，分別用等體積的石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和甲醇萃取過夜。取有機相用真空旋轉蒸發儀于60 ℃蒸干，然后用水溶解，放置于凍干機冷凍干燥，再用10 mL水溶解，測定殺線蟲活性。

1.4.5 菌株1A00493殺線蟲活性物質的分離與鑒定

1.4.5.1 活性物質甲醇粗提物制備

取保存于30%甘油的菌株1A00493，平板劃線活化，挑取單菌落接種于2216e 培養基中，于28 ℃、180 r·min-1培養12 h 作為種子液。按1%接種量將種子液接入搖瓶中，于28 ℃、180 r·min-1培養48 h。將發酵液于4 ℃、8 000 r·min-1離心30 min，棄沉淀，收集上清液。將等體積甲醇與上清液混合，4 ℃放置過夜，再8 000 r·min-1離心30 min 除去沉淀。所得混合溶液經過60 ℃真空旋轉蒸干，析出的固體物質再用少量甲醇溶解，再離心，除去不溶于甲醇的高聚物和蛋白質等雜質。最后所得溶液即為殺線蟲活性物質甲醇粗提物，于4 ℃保存。

1.4.5.2 正相硅膠柱層析分離

樣品處理：將甲醇粗提物旋蒸濃縮，加入適量60～80目硅膠粉及二氯甲烷，充分混勻，然后旋蒸至硅膠顆粒干燥均一，使甲醇粗提物與硅膠結合。

硅膠柱裝柱：柱內徑6 cm，加入高約12 cm的200～300目硅膠粉和約2 L石油醚，使硅膠顆粒活化并平衡，再加入適量石英砂使柱面平整。

硅膠柱層析：硅膠柱內加入蒸干的結合甲醇粗提物的60～80目硅膠顆粒，再鋪一層石英砂，先用石油醚-乙酸乙酯(1∶1，體積比，下同)的混合液洗掉小極性雜質，再用乙酸乙酯-甲醇(1∶1)的混合液洗脫中強極性分子，收集洗脫液，每管10 mL。直至強極性的色素分子被洗脫下來，然后用甲醇洗脫，收集洗脫液。

活性組分分離與鑒定：將每管洗脫液用毛細管點樣TLC板，0.3%茚三酮顯色。將收集的洗脫液分組，每5管設為一組，60 ℃旋蒸干，用4 mL甲醇溶解，冷凍干燥后用等體積水溶解，細菌過濾器除去硅膠顆粒備用，將樣品做不同濃度稀釋測定各組分殺線蟲活性。

1.4.5.3 反相硅膠柱層析分離

濕法裝柱：稱取一定量硅膠，加甲醇攪拌呈勻漿狀，裝入抽濾瓶中于0.06 MPa真空脫氣2 h，將填料加入層析柱中。

平衡活化：流動相甲醇和乙腈過有機相濾膜，先用甲醇沖洗2～3個柱體積，再用超聲脫氣的10%乙腈水溶液沖洗2～3個柱體積。

上樣：將甲醇溶解的正相硅膠活性物質樣品放入烘箱烘干，加入10%乙腈水溶液溶解，0.22μm濾膜過濾，加入柱內。

收樣：控制恒流泵流速為1 mL·min-1，10%乙腈水溶液洗脫，按時間收集流出液，每管收集約4 mL，收集40管，試管按順序編號1～40。

活性檢測：TLC點板，0.3%茚三酮顯色。根據顯色結果，將顯色的樣品及其前后的樣品分別合并成3組樣品，真空旋轉蒸發濃縮，進行殺線蟲活性檢測。

“齋，戒潔也”，指在敬神之前戒除不潔使自身清凈，由此而引申為一種清幽凈潔的建筑物，如書房稱之書齋，學舍謂之東齋。“志歸齋”是寓園最早的建筑物，“當開園之初，偶市得敞(敝)椽，移置于此”。其建筑格局是：“齋左右，貫以長廊，右達寓山草堂，左登笛亭。”[3]428

1.4.5.4 LH-20葡聚糖凝膠柱層析分離

依次用水、NaOH-NaCl水溶液(8 g NaOH，30 g NaCl，1 000 mL水)、水、甲醇清洗LH-20填料，新填料可直接用甲醇溶脹。0.06 MPa真空脫氣2 h后裝柱，使用甲醇-水洗脫劑進行洗脫，逐漸增加甲醇含量至50%，平衡使用1～2個柱體積。樣品用50%甲醇溶解，上樣。設置恒流泵流速為1.0 mL·min-1，每管收集約4 mL，收集30管，試管按順序編號1～30。將每管收集液用0.3%茚三酮顯色，初步檢測活性組分；將顯色部分做薄層層析。將顯色點樣品真空旋轉蒸發濃縮，進行殺線蟲活性檢測。

1.4.5.5 示差折光高效液相色譜(RID-HPLC)分離純化

用水和異丙醇沖洗管道，連接色譜柱，用異丙醇置換新色譜柱中的封存劑，最后用洗脫流動相沖洗色譜柱，將泵、進樣器、色譜柱和檢測器連接好。80%乙腈水溶液用0.22μm有機濾膜過濾，超聲脫氣30 min。在合適泵壓下設定程序，放入樣品，進行液相色譜分析。液相色譜條件：流動相為80%乙腈水溶液，單次樣品時間為20 min，柱溫為30 ℃，檢測器為RID-10A。

分別收集各個液相峰的樣品冷凍干燥，用水復溶，0.22μm濾膜過濾除菌后，進行殺線蟲活性檢測，實驗重復3次。

1.4.5.6 Q-TOF液相色譜-質譜聯用分析

回收液相色譜活性物質峰，采用液質聯用(LC-MS)對活性物質進行鑒定。

色譜條件：采用梯度洗脫，0～2 min流動相為5%乙腈水溶液，2～10 min 5%～90%乙腈水溶液，10～12 min 90%乙腈水溶液平衡2 min,流速0.3 mL·min-1，進樣量1μL。質譜條件：雙源ESI，干燥溫度350 ℃，干燥氣流9 L·min-1，噴霧器壓力40 psi。利用Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis B.05.00軟件分析和預測活性物質的分子量、分子式和物質的具體結構與特性。

2 結果與討論

由表1可知，菌株1A00493發酵上清液原液及稀釋2倍液在處理根結線蟲48 h后，校正死亡率達到100%；稀釋5倍液在處理根結線蟲48 h后的校正死亡率為50.2%。表明菌株1A00493發酵上清液的活性物質對南方根結線蟲有殺死作用。

表1 不同稀釋倍數的發酵上清液殺線蟲活性測定結果

Tab.1 The determination results of nematicidal activity of fermentation supernatant by diluting different multiple

2.2 發酵上清液殺線蟲活性物質理化性質研究

2.2.1 發酵時間對活性物質殺線蟲活性的影響(圖1)

圖1 發酵時間對活性物質殺線蟲活性的影響Fig.1 Effect of fermentation time on nematicidal activity of active substance

由圖1可以看出，在發酵12 h時，活性物質產量很低或沒有產生，線蟲校正死亡率最低；隨著發酵時間的延長，48 h時的線蟲校正死亡率達到最高；在60 h、72 h時菌株已經到生長后期，活性物質因次級代謝產物發生變化導致殺線蟲活性降低。綜合考慮，選擇48 h為最適發酵時間。

2.2.2 紫外照射時間對活性物質殺線蟲活性的影響(圖2)

圖2 紫外照射時間對活性物質殺線蟲活性的影響

由圖2可以看出，各個處理組的殺線蟲活性相差不大，當紫外照射時間為120 min時，線蟲校正死亡率與無紫外照射時的差別不大。表明菌株1A00493產殺線蟲活性物質對紫外照射有耐受性。

2.2.3 溫度對活性物質殺線蟲活性的影響(圖3)

圖3 溫度對活性物質殺線蟲活性的影響Fig.3 Effect of temperature on nematicidal activity of active substance

由圖3可以看出，在溫度低于100 ℃時，各個處理組的殺線蟲活性相差不大，但在121 ℃處理后殺線蟲活性稍微降低，但影響不顯著。表明菌株1A00493產殺線蟲活性物質的結構比較穩定，不易被高溫破壞，具有一定的熱穩定性。

2.2.4 pH值對活性物質殺線蟲活性的影響(圖4)

圖4 pH值對活性物質殺線蟲活性的影響Fig.4 Effect of pH value on nematicidal activity of active substance

由圖4可以看出，pH值為11的處理組線蟲校正死亡率降至80%，其它幾個處理對活性物質殺線蟲活性影響不大。表明菌株1A00493產殺線蟲活性物質對酸堿有較好的耐受性。

2.2.5 殺線蟲活性物質對蛋白酶的敏感性(表2)

由表2可以看出，各個酶處理對活性物質殺線蟲活性基本沒什么影響，表明菌株1A00493產殺線蟲活性物質對這幾種蛋白酶不敏感。

表2 活性物質對蛋白酶的敏感性

Tab.2 The sensitivity of active substance to protease

2.2.6 硫酸銨沉淀處理

各個處理所得蛋白的線蟲校正死亡率基本為0，表明蛋白沉淀物沒有殺線蟲活性。

根據發酵上清液中活性物質可以耐高溫，對蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶不敏感，以及硫酸銨沉淀的蛋白沉淀物無殺線蟲活性，可以推斷菌株1A00493產殺線蟲活性物質不屬于蛋白類物質。

2.2.7 活性物質分子量大小

實驗發現，菌株1A00493發酵上清液濾過3 kDa超濾管的濾過液仍然有殺線蟲活性，可以推測殺線蟲活性物質為小分子類物質。

2.2.8 活性物質有機溶劑溶解性(表3)

表3 活性物質在有機溶劑中的殺線蟲活性

Tab.3 Nematicial activity of active substance in organic solvent

發酵液處理方式水甲醇氯仿乙酸乙酯正丁醇石油醚上清液AABDDD沉淀AAAAA水(對照)D-----

注：A，死亡率≥90%；B，90%>死亡率≥70%；C，70%>死亡率≥10%；D，級死亡率<10%。

由表3可以看出，用甲醇和氯仿溶解的活性物質的殺線蟲活性最高，活性物質在這2種有機溶劑中溶解性較好。由于氯仿的毒性相對較高，因此可以用甲醇來萃取活性物質進行下一步的分離純化。

2.3 殺線蟲活性物質的分離純化

2.3.1 正相硅膠柱層析分離

利用正相硅膠柱分離甲醇粗提物，將收集的洗脫液分為20個組分(A1-A20)。發現用乙酸乙酯-甲醇洗脫的中強極性組分A9、A10、A11和A12有明顯的殺線蟲活性(表4)，其它組分無殺線蟲活性。將20個組分用0.3%茚三酮顯色，結果顯示殺線蟲活性組分能夠顯色，非活性組分不顯色或顯色不明顯，表明殺線蟲活性物質可能含有氨基，能和茚三酮顯色反應。因此，0.3%茚三酮可初步作為活性物質顯色指示劑。

表4 正相硅膠柱層析分離各組分的殺線蟲活性(24 h)

Tab.4 Nematicidal activities of different components separated from positive silica gel column chromatography (24 h)

2.3.2 反相硅膠柱層析分離

將正相硅膠柱層析分離的活性組分A9、A10、A11和A12合并，進行反相硅膠柱層析分離純化。樣品上柱后將收集的洗脫液分成40管。0.3%茚三酮顯色結果顯示，40管洗脫液中間部分樣品顯色，前后部分不顯色或顯色不明顯，將所有樣品合并成3個組分(B1、B2和B3)，B2代表顯色部分樣品，B1和 B3分別是顯色前、后兩部分樣品。將3個組分冷凍干燥，用水溶解后進行殺線蟲活性檢測，結果見表5。

表5 反相硅膠柱層析分離各個組分的殺線蟲活性(24 h)

Tab.5 Nematicidal activities of different components separated from reverse silica gel column chromatography(24 h)

由表5可以看出，組分B2有明顯的殺線蟲活性。

2.3.3 LH-20葡聚糖凝膠柱層析分離

將收集的30管洗脫液，用0.3%茚三酮顯色，結果和反相硅膠柱層析分離一樣，中間部分有7管樣品顯色，前后部分不顯色或顯色不明顯，將所有樣品合并成3個組分(C1、C2和C3)，C2代表顯色部分樣品，C1、C3分別是顯色前、后兩部分樣品。將3個組分冷凍干燥，用水溶解后進行殺線蟲活性檢測。結果表明，組分C2有明顯的殺線蟲活性。

將組分C2硅膠板點樣，用正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶2的溶劑系統薄層層析，然后用0.3% 茚三酮顯色，結果顯示有3條帶，可能有3種或3種以上的物質。

2.3.4 RID-HPLC分離純化

將LH-20葡聚糖凝膠柱層析分離的樣品用80%乙腈水溶液溶解進行RID-HPLC分析，結果如圖5所示。

按RID-HPLC圖譜分為7個部分收集。將收集的各部分樣品冷凍干燥，然后用水溶解，進行殺線蟲活性檢測。經驗證，樣品2和樣品3有殺線蟲活性，在處理線蟲48 h后，線蟲校正死亡率都達到100%。

2.3.5 Q-TOF液相色譜-質譜聯用分析結果

圖5 殺線蟲活性物質的RID-HPLC圖譜Fig.5 RID-HPLC chromatogram of nematicidal active substance

LC-MS分析顯示樣品2的總離子流圖譜有2個峰(圖6)，每個峰對應的一級質譜圖見圖7。

圖6 樣品2的總離子流圖譜Fig.6 Total ion chromatogram of sample 2

圖 7 樣品2活性物質的一級質譜圖Fig.7 First-order mass spectra of active substance of sample 2

由圖7可以看出，樣品2中響應度最高的主要有3種物質，分子量分別為234 Da、253 Da和120 Da，預測分析這3種物質都是未知的物質。

樣品3的總離子流圖譜有2個峰(圖8)，每個峰對應的一級質譜圖見圖9。

圖8 樣品3的總離子流圖譜Fig.8 Total ion chromatogram of sample 3

由圖9可以看出，樣品3中響應度最高的主要有2種物質，分子量分別為234 Da和113 Da，其中分子量為113 Da的物質預測為已知化合物肌酸酐，肌酸酐是反應腎功能主要情況的指標，因此推測樣品3中分子量為234 Da的物質可能起主要殺線蟲作用。

圖9 樣品3活性物質一級質譜圖Fig.9 First-order mass spectra of active substance of sample 3

樣品2和樣品3都有殺線蟲活性，且都有分子量為234 Da的物質。分析分子量為234 Da的物質很有可能是殺線蟲活性物質，也有可能分子量為253 Da和120 Da的物質起協同作用殺線蟲。

3 結論

以一株深海獨島枝芽胞桿菌1A00493為研究對象，對其產生的殺南方根結線蟲的代謝活性物質進行理化分析與分離純化，并對活性物質進行結構鑒定與預測。結果表明：菌株1A00493發酵上清液對南方根結線蟲有顯著的殺蟲作用，發酵上清液處理南方根結線蟲48 h校正死亡率達到100%。該殺線蟲活性物質穩定性強，不同濃度硫酸銨沉淀的蛋白沉淀物無殺線蟲活性，發酵上清液濾過3 kDa超濾管仍然有活性，能溶解在甲醇和氯仿中，因此推測活性物質是中強極性小分子類物質。將發酵上清液用甲醇萃取，依次通過正相硅膠柱、反相硅膠柱、LH-20葡聚糖凝膠柱分離以及RID-HPLC對活性物質進行分離純化，根據LC-MS分析推測活性物質極有可能是分子量為234 Da的未知化合物，也有可能分子量為253 Da和120 Da的物質起協同作用殺線蟲。在此研究基礎上，可對活性物質進行核磁共振結構鑒定，進一步深入研究其殺線蟲作用機理，為菌株1A00493在農業生產上的應用提供理論基礎和技術指導。

[1] WEI L，SHAO Y，WAN J，et al.Isolation and characterization of a rhizobacterial antagonist of root-knot nematodes[J].PLoS One，2014，9(1):1-5.

[2] 張博，王會利，慕立義．蔬菜根結線蟲的發生與防治[J]．農藥，2002,43(9):4-5.

[3] NEIDIG N，PAUL R J,SCHEU S,et al.Secondary metabolites ofPseudomonasfluorescensCHA0 drive complex non-trophic interactions with bacterivorous nematodes[J].Microbial Ecology，2011，61(4)：853-859.

[4] HUSSAIN M，MUKHTAR T，KAYANI M.Assessment of the damage caused byMeloidogyneincognitaon okra (Abelmoschusesculentus)[J].Journal of Animal and Plant Sciences，2011，21(4)：857-861.

[5] 王新榮，馬超，任路路，等.根結線蟲引起的植物根結形態與形成機理研究進展[J].華中農業大學學報，2010，29(2)：251-256.

[6] 丹陽，黃忠良，魏孝義，等.松材線蟲的天然毒素研究進展[J].熱帶亞熱帶植物學報，2004，12(4)：381-387.

[7] SALOMON C E，MAGARVEY N A,SHERMAN D H.Merging the potential of microbial genetics with biological and chemical diversity：an even brighter future for marine natural product drug discovery[J].Natural Product Reports，2004，21(1)：105-121.

Nematicidal Active Substance Produced byDeep-SeaVirgibacillusdokdonensis1A00493

ZHENG Na1,HUANG Dian1，SHAO Zong-ze2，YU Zi-niu1，ZHANG Ji-bin1*

(1.StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology，CollegeofLifeScienceandTechnology，HuazhongAgriculturalUniversity，NationalEngineeringResearchCenterforMicrobialPesticides，Wuhan430070，China；2.KeyLaboratoryofMarineBiogeneticResources，ThirdInstituteofOceanography，StateOceanicAdministration，Xiamen361005，China)

A deep-seaVirgibacillusdokdonensis1A00493，which had nematicidal activity againstMeloidogyneincongnita，was taken as the research object.The nematicidal activity of fermentation supernatant was determined,also the physical and chemical analyses on nematicidal active substance were carried out.The crude extracts of fermentation supernatant were isolated and purified by a positive silica gel column，followed by a reverse silica gel column，a Sephadex LH-20 gel column and RID-HPLC.Results showed that，nematicidal active substance was insensitive to high temperature，protease and pH value，ammonium sulfate precipitation had no nematicidal activity，the supernatant filtered through a 3 kDa ultrafiltration tube remained active，and it was easily soluble in methanol and chloroform.It is speculated that the active substance is a moderate polarity compound with small molecules.The results of LC-MS show that,the nematicidal active substance most likely contain three compounds，and the active substance molecular weight may be 234 Da.

deep-seaVirgibacillusdokdonensis；Meloidogynespp.；active substance；isolation and purification

國家重點基礎研究發展計劃項目(2013CB127504)

2016-12-19

鄭娜(1988-)，女，湖北武漢人，碩士研究生，研究方向：微生物工程及制劑；通訊作者：張吉斌，教授，E-mail:zhangjb@mail.hzau.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.05.005

S482.3

A

1672-5425(2017)05-0021-07

鄭娜，黃典，邵宗澤，等.深海獨島枝芽胞桿菌1A00493殺根結線蟲活性物質研究[J].化學與生物工程，2017，34(5)：21-27.