穩心顆粒對大鼠心肌肥厚及Connexin43表達的影響

龍俊蓉++鄧彪++劉盛權++唐芬++譚文婷++劉茂軍++楊軍++褚春

[摘要] 目的 觀察穩心顆粒對壓力超負荷大鼠心肌肥厚和QT離散度以及縫隙連接蛋白43（Cx43）表達的影響。 方法 取45只雄性SD大鼠，以完全隨機法分為正常組（N組）、心肌肥厚組（H組）、穩心顆粒組（W組）。采用腹主動脈縮窄法構建心肌肥厚大鼠模型，給予穩心顆粒6.25 g/（kg·d）治療12周后，行超聲心動圖檢測，并測定大鼠QT離散度，處死大鼠后以HE染色觀察心肌病理形態變化，免疫組化法檢測左室心肌Cx43蛋白的表達及分布，逆轉錄-鏈式聚合酶法檢測心肌細胞Cx43 mRNA的表達。 結果 創建了壓力超負荷誘導的心肌肥厚大鼠模型，超聲心動圖檢測顯示，與N組比較，H組大鼠出現明顯心肌肥厚；W組和H組比較，以上參數有所改善。此外，H組的QT離散度比N組明顯增加，而經穩心顆粒干預后的W組QT離散度較H組降低。同時，與N組大鼠比較，H組可見心肌細胞肥大、排列紊亂，且左室心肌組織Cx43的蛋白和mRNA表達明顯減少；而W組和H組比較，心肌細胞排列紊亂則有所改善，Cx43的蛋白和mRNA的表達亦明顯上調。 結論 穩心顆粒可改善壓力超負荷大鼠的心肌肥厚，并降低QT離散度和改善心肌Cx43的重構。

[關鍵詞] 穩心顆粒；心肌肥厚；Cx43；QT離散度

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（a）-0008-04

[Abstract] Objective To observe the effects of Wenxin Granules on cardiac hypertrophy and QT dispersion and the expression of connexin43 （Cx43） in pressure-overloaded rats. Methods Forty-five male Sprague-Dawley rats were divided into normal group （group N）， hypertrophy group （group H） and Wenxin Granules group （group W） by completely randomized method. The rat model of cardiac hypertrophy was established by constriction of abdominal aorta. When treated with Wenxin Granules 6.25 g/（kg·d） for 12 weeks， these rats were detected by echocardiography and QT dispersion. The pathological morphology of ventricle tissue was observed by HE staining， the expression of Cx43 protein and Cx43 mRNA in left ventricle was respectively detected by immunohistochemistry and RT-PCR after rats were sacrificed. Results The rat model of cardiac hypertrophy induced by pressure overload was established. Compared with group N， the rats in group H had obvious hypertrophy. Compared with group H， the above parameters were improved in group W. In addition， the QT dispersion of group H was significantly higher than that of group N， and the QT dispersion of group W was lower than that of group H. Meanwhile， compared with group N， group H showed hypertrophy and disorder of cardiac muscle cell， and the expression of Cx43 protein and mRNA in left ventricle myocardium was significantly decreased； while the hypertrophy and disorder were improved in group W when compared with group H， Cx43 protein and mRNA expression was also significantly increased. Conclusion Wenxin Granules can improve cardiac hypertrophy in pressure-overloaded rats， decrease QT dispersion and improve the remodeling of Cx43 in myocardium.

[Key words] Wenxin Granules； Cardiac hypertrophy； Cx43； QT dispersion

心肌肥厚是心臟對于長期壓力負荷過大或者容量負荷過大所產生的一種適應性反應[1]，從而發生細胞肥大、排列紊亂等一系列病理改變，其不僅可以引起多種離子通道重構，也可導致縫隙連接重構，從而誘發各種心律失常。心肌肥厚作為心衰進展、心梗、猝死等心血管事件發生的一個獨立危險因素[2-3]，能夠顯著增加住院率和病死率，所涉及的機制就與其導致的心臟電生理重構有關，而縫隙連接重構又是電生理失穩態的關鍵[4]。縫隙連接與細胞間的化學交流和電沖動的傳導密切相關[5]，有研究發現，心肌中主要有三種縫隙連接蛋白，其中Cx43在心室肌中表達最多，少量分布于心房肌。當發生心肌肥厚時，Cx43表達下調[6]，引起心肌細胞解偶聯，這與心律失常的發生及進展息息相關。因此，以Cx43為靶點研發抗心律失常藥物成為當今的一大熱點。穩心顆粒對治療房顫、多形性室速等心律失常具有相當理想的效果，可降低QT離散度（QTd）[7]，這可能與其選擇性阻滯心房鈉通道和抑制心室晚電位有關[8]，但其是否能對細胞間的連接蛋白重構起作用，目前尚缺乏相關研究。本研究旨在探討穩心顆粒對肥厚心肌和Cx43表達的影響，了解其對肥大心肌細胞及縫隙連接重構的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

45只6周齡SPF級雄性SD大鼠（180～200 g），動物合格證號：SYXK（湘）2015-0001，購自南華大學動物實驗中心，飼養于恒溫（22±1℃）恒濕環境中，人工照明12 h，可自由獲得水和食物。步長穩心顆粒（陜西步長制藥公司，批號1505093）；免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、一抗Cx43（10D101）、羊抗兔二抗（150361）（武漢博士德公司）。

1.2 制備心肌肥厚模型

采用改良腹主動脈縮窄法[9]造模。以完全隨機法將大鼠分成三組：正常組（N組），心肌肥厚組（H組），穩心顆粒組（W組）。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，劑量為每只3 mL/kg。取左側臥位固定大鼠，以右腎的體表投影為中心做一2～3 cm的縱行切口后尋找右腎動脈，在腹主動脈發出右腎動脈分支點上方約2 mm處分離腹主動脈，H組和W組大鼠用4號縫線將直徑0.8 mm的針頭與腹主動脈一起結扎，隨后抽出針頭，還納臟器，縫合切口。N組不結扎腹主動脈，余處理相同。W組給予溶解了穩心顆粒6.25 g/（kg·d）的生理鹽水灌胃，N組和H組則予等量生理鹽水。12周后測左室后壁及室間隔厚度，明顯增加提示造模成功。

1.3 測量QTd

12周后，同法麻醉并固定大鼠，將刺激電極（張家口教學儀器廠）插入大鼠皮下，行常規12導心電圖，Powlab 16導生理記錄儀（澳大利亞埃得公司）輸入信號，QTd即為最大QT間期（QTmax）與最小QT間期（QTmin）之差。

1.4 檢測超聲心動圖

12周后，麻醉并固定大鼠，胸前區備皮。用超聲探頭（頻率為13 MHz）置于左胸前，圖像深度調整至2.0～2.5 cm，由心臟彩超醫生測量左室后壁舒張末期厚度（LVPWd）、舒張末期室間隔厚度（IVSd）及左室舒張期內徑（LVIDd）。

1.5 測定左室重量

稱量大鼠體重（BW），麻醉開胸，取出心臟后用生理鹽水洗凈，保留左室和室間隔，濾紙吸干水分，稱量左室重量（LVW），計算左室重量指數（LVM/BW）。

1.6 HE染色觀察

取部分左室心肌于10%甲醛中固定，石蠟包埋、切片，按步驟行HE染色，最后樹膠封片，在光鏡下觀察細胞形態。

1.7 檢測心肌Cx43蛋白

取2～3 mm縱切左心室組織，按說明書行免疫組化染色，光鏡下心肌中的深棕色顆粒即為Cx43。使用IPP 6.0軟件測量染色區域的總光密度值和染色面積，兩者比值為平均光密度值（OD值）。

1.8 檢測細胞Cx43 mRNA

稱取80 mg心肌，研磨成粉末后提取組織RNA，再按逆轉錄試劑盒（美國Fermentas公司）說明書將11.5 μL RNA逆轉錄成cDNA。參考Genebank資料設計并合成Cx43及β-actin的引物，在PCR儀（德國Biometra公司）中分別擴增兩者序列長度至588 bp和400 bp。反應條件：94℃預變性2 min，再變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s并循環35次，最后72℃延伸5 min。取適量PCR產物，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察，AlphaImager軟件掃描各DNA條帶，測得灰度值后計算半定量灰度比值（IDV比值）。

1.9 統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物存活、電生理及心臟超聲結果

N組死亡4只，H組死亡5只，W組死亡6只，共30只大鼠完成實驗。造模12周后，各組大鼠QTd結果顯示：與其他兩組比較，H組大鼠QTd顯著增加（P < 0.05），而N組與W組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。大鼠LVW/BW結果顯示：與N組比較，H組大鼠的LVM/BW增加明顯（P < 0.05），而N組與W組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。各組大鼠心臟超聲結果顯示：與N組比較，H組大鼠心臟LVPWd、IVSd明顯增加，LVIDd則明顯減小；與H組比較，W組大鼠LVPWd、IVSd有所降低，LVIDd明顯增加，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 HE染色結果

鏡下觀察大鼠心肌組織形態結構變化，結果顯示與N組比較，H組心肌細胞排列紊亂，而用穩心顆粒干預的W組，心肌細胞排列則有所改善。見圖1（封三）。

2.3 心肌Cx43蛋白表達的檢測

免疫組化結果顯示：左室心肌組織Cx43免疫標記陽性蛋白呈深棕色顆粒（箭頭所示）。與N組比較，H組大鼠心肌組織Cx43蛋白表達下調，且排列紊亂。與H組比較，W組大鼠心肌組織Cx43表達增加。見圖2（封三）。

2.4 心肌組織Cx43 mRNA表達的檢測

實驗大鼠心肌Cx43及β-actin的mRNA表達水平及電泳條帶位置見圖3。從圖中可以看出，H組大鼠心肌組織Cx43mRNA的IDV比值較N組減小（P < 0.05）；而W組Cx43 mRNA的IDV比值較H組增大，提示穩心顆粒干預能上調壓力超負荷下大鼠肥厚心肌組織Cx43 mRNA表達。

3 討論

心肌肥厚是長期處于超負荷狀態的心肌細胞在神經體液因素影響下發生肥大、間質增生等病理變化[10]，是心臟病變時的一個代償機制，伴隨著心肌重構進展到失代償期，引起心肌收縮力減退，最終發生心力衰竭[11-12]。本研究為了探究穩心顆粒對心肌肥厚及Cx43的作用，通過腹主動脈縮窄法構建了心肌肥厚大鼠模型，超聲心動圖顯示H組大鼠心臟LVPWd、IVSd明顯增加，LVIDd則明顯減小，提示心肌出現明顯肥厚，且HE染色結果表明H組大鼠心肌細胞肥大，排列紊亂，進一步證明造模成功。

Cx43蛋白作為縫隙連接蛋白的一種，主要存在于心室肌。已有文獻報道[13-14]，Cx43的分布和表達在心肌重構中有重要地位，因其正常的表達和分布是維持心臟正常電生理活動及協調舒縮功能的基礎之一[15]，而心肌重構又可引起電生理紊亂及心臟舒縮功能受限。QTd是反映心室肌細胞復極不均一性和心電活動不穩定性的一項電學定量指標，因此測定QTd可以了解各組大鼠心電生理有無異常。本研究結果顯示，心肌肥厚的大鼠QTd明顯增加，表明心電活動受到影響。大鼠舒縮功能雖未明顯受限，但心肌細胞已有肥大，延長干預時間或許就能出現。本研究免疫組化結果表明，H組大鼠心肌細胞Cx43蛋白表達減少，分布異常，電泳結果顯示mRNA表達下降，提示心肌肥厚引起了Cx43的重構。研究表明，負荷誘導下的心肌肥厚可引起心肌細胞Cx43的表達下調[16-17]，這與本研究結果吻合。此外，有學者認為，Cx43在心肌缺血/再灌注損傷及心肌保護方面將是一個新的治療靶點[18-19]，因此，研究出對改善Cx43重構的藥物有很大的前景。

穩心顆粒以中醫理念為基礎，經反復篩選，最終由三七、黨參、甘松、黃精、琥珀五味中藥組成[7]，是療效可觀的抗心律失常中成藥。有研究表明，穩心顆粒能在一定程度上降低不良神經內分泌因素對心血管的破壞性，本研究結果也提示了穩心顆粒干預12周后的大鼠心肌肥厚得到改善。朱艷霞等[20]研究顯示，穩心顆粒可抑制膜離子通道作用及動作電位延長，改善心肌細胞超微結構的穩定性，進而改善心血管的電重構，本研究發現經穩心顆粒干預后，H組大鼠的QTd明顯降低，進而改善了心肌復極時限延長。但其在對Cx43重構方面有無干預作用，尚無相關研究。本研究發現，穩心顆粒能夠上調肥厚心肌細胞Cx43蛋白和mRNA的表達，改善Cx43的紊亂排列，提示穩心顆粒可能在一定程度上干預了縫隙連接蛋白的重構。

綜上所述，穩心顆粒可以改善壓力超負荷下的心肌肥厚，機制可能與其改善Cx43重構有關，但具體的信號調控機制仍需要進一步的研究。與此同時，穩心顆粒除能有效抗心律失常外，還有望成為改善心肌肥厚，抑制心肌重構、延緩心力衰竭進程的第一種中成藥。

[參考文獻]

[1] 趙神鐳，李丹露.心肌肥厚模型建立方法的研究進展[J].中國藥房，2014，25（5）：473-475.

[2] Guan X，Lu W，Liu Z，et al. miR-106a promotes cardiac hypertrophy by targeting mitofusin 2 [J]. J Mol Cell Cardiol，2016，99：207-217.

[3] Podrid PJ，Myerburg RJ. Epidemiology and stratification of risk for sudden cardiac death [J]. Clin Cardiol，2005，28（11）：3-11.

[4] 陳濟明，潘大彬.縫隙連接重塑與心律失常上游治療[J].承德醫學院學報，2016，33（5）：432-436.

[5] Watanabe M，Masaki K，Yamasaki R，et al. Th1 cells downregulate connexin 43 gap junctions in astrocytes via microglial activation [J]. Sci Rep，2016，6：383-387.

[6] 尚好，錢雅珍，陶厚權，等.貫葉連翹提取物對擴張型心肌病大鼠縫隙連接蛋白Cx43的影響[J].中國應用生理學雜志，2013，29（4）：330-332.

[7] 謝曉彤，戴小華.穩心顆粒對冠心病QT間期離散度影響的Meta分析[J].安徽中醫藥大學學報，2016，35（4）：93-96.

[8] 郭繼鴻.穩心顆粒：國際研究最新進展[J].臨床心電學雜志，2015，24（1）：51-64.

[9] 楊濤，張偉，張雷.大鼠腹主動脈縮窄模型的制備及其效果的探討[J].中國老年學，2009，29（1）：24-26.

[10] Chen A，Li W，Chen X，et al. Trimetazidine attenuates pressure overload-induced early cardiac energy dysfunction via regulation of neuropeptide Y system in a rat model of abdominal aortic constriction [J]. BMC Cardiovasc Disord，2016，16（1）：225.

[11] 賀莉，肖建民，付暉，等.心肌肥厚心力衰竭兔室性心律失常與氧化應激[J].中國心臟起搏與心電生理雜志，2012，26（5）：427-430.

[12] 廖家有，夏勇.大蒜素對腹主動脈縮窄大鼠左室肥厚及鈣調神經磷酸酶信號通路的影響[J].中國醫藥導報，2012，9（5）：18-20.

[13] 康曼，袁鳳波.縫隙連接蛋白43對心衰進程作用的研究進展[J].山東醫藥，2017，57（1）：106-108.

[14] Salameh A，Krautblatter S，Karl S，et al. The signal transduction cascade regulating the expression of the gapjunction protein connexin43 by beta-adrenoceptors [J]. Br J Pharmacol，2009，158（1）：198-208.

[15] Desplantez T. Cardiac Cx43，Cx40 and Cx45 co-assembling：involvement of connexins epitopes in formation of hemichannels and Gap junction channels [J]. BMC Cell Biol，2017，18（Suppl 1）：3.

[16] Bupha-Intr T，Haizlip KM，Janssen PM. Temporal changes in expression of connexin 43 after load-induced hypertrophy in vitro [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296（3）：H806-H814.

[17] Severs NJ，Bruce AF，Dupont E，et al. Remodelling of gap junctions and connexin expression in diseased myocardium [J]. Cardiovasc Res，2008，80（1）：9-19.

[18] Schulz R，Grge PM，Grbe A，et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury，cardioprotection and neuroprotection [J]. Pharmacol Ther，2015，153：90-106.

[19] Chen CC，Kuo CY，Chen RF. Role of CAPE on cardiomyocyte protection via connexin 43 regulation under hypoxia [J]. Int J Med Sci，2016，13（10）：754-758.

[20] 朱艷霞，田宗文，朱紅霞，等.去甲腎上腺素對培養心肌細胞肥大和凋亡的作用[J].解剖學雜志，2007，30（1）：7-11.

（收稿日期：2017-01-02 本文編輯：張瑜杰）