氨溴索在百草枯中毒大鼠肺纖維化中的保護作用

肖小榮++陳思偉++詹蘭芬++羅金明++李祥

[摘要] 目的 研究鹽酸氨溴索注射液（氨溴索）對百草枯（PQ）中毒肺纖維化的影響及相關機制。 方法 將105只SD大鼠隨機分為5組：正常對照組（NC組）、百草枯中毒組（PQ組）、氨溴索普通劑量治療組（PN組）、氨溴索大劑量治療組（PL組）、氨溴索超大劑量治療組（PE組），采取腹腔注射法構建動物模型：NC組注射1.25 mg/kg生理鹽水；PQ組注射25 mg/kg 2%PQ溶液；PN組注射25 mg/kg 2%PQ溶液+30 mg/（kg·d）氨溴索；PL組注射25 mg/kg 2%PQ溶液+50 mg/（kg·d）及PE組注射25 mg/kg 2%PQ溶液+90 mg/（kg·d）。在模型建立后21 d處死動物，肺組織行HE和Masson染色分別觀察炎癥以及纖維化情況；ELISA法測定支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白介素-6（IL-6）含量，q-PCR和Western blot分別測定肺組織中組織金屬蛋白酶抑制因子1（TIMP-1）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）mRNA和蛋白的表達。 結果 NC組肺組織正常，百草枯模型組大鼠肺損傷和肺組織膠原沉積明顯。各劑量氨溴索治療均能顯著減少百草枯中毒誘導的大鼠肺組織膠原沉積，同時伴有IL-6、TIMP-1和TNF-α表達的顯著下降（P < 0.05）。在氨溴索治療各組中，與PN組相比，大劑量治療和超大劑量治療更能夠抑制百草枯中毒誘導的大鼠肺纖維化（P < 0.05），降低肺組織IL-6、TIMP-1和TNF-α的表達（P < 0.05）。結論 氨溴索可減輕大鼠百草枯中毒所致的肺纖維化，有望成為治療百草枯中毒所致肺纖維化的有效方法。

[關鍵詞] 氨溴索；百草枯；肺纖維化；白介素-6；基質金屬蛋白酶抑制因子1；腫瘤壞死因子α

[中圖分類號] R595.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（a）-0035-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of ambroxol on paraquat-induced pulmonary fibrosis in rats. Methods 105 SD rats were randomly divided into five groups， NC group treated with 1.25 mg/kg normal saline， PQ group treated with 25 mg/kg 2% paraquat， PN group treated with 25 mg/kg 2% paraquat+30 mg/（kg·d） ambroxol， PL group treated with 25mg/kg 2% paraquat+50 mg/（kg·d） ambroxol， PE group treated with 25 mg/kg 2% paraquat+90 mg/（kg·d） ambroxol. The rats were kiiled on 21 d after modeling， the degrees of acute pulmonary injury and fibrosis were detected by HE staining and Masson staining； the mRNA and protein expressions of TIMP-1 and TNF-αwere evaluated by real-time qPCR and Western-blot respectively. Results The lung tissue was normal in NC group， while it showed that significant injury of lungs， fibrosis and large collagen deposition in PQ group. After ambroxol treatment， fibrosis and large collagen deposition reduced， expression of IL-6， TIMP 1-and TNF-α increased （P < 0.05）. Among ambroxol treatment group， compared with PN group， ambroxol at high or large dose could restrained more significantly paraquat poisoning inducing fibrosis and large collagen deposition in rats （P < 0.05）， and reduced expression of IL-6， TIMP 1-and TNF-α （P < 0.05）. Conclusion Ambroxol treatment alleviates paraquat poisoning-induced lung fibrosis. Ambroxol might be a promising way to treat araquat poisoning-induced lung fibrosis.

[Key words] Ambroxol； Paraquat； Lung fibrosis； IL-6； TIMP-1； TNF-α

百草枯中毒可出現嚴重急性肺損傷及進行性肺間質纖維化，目前尚無特效解毒藥[1-2]。研究表明氨溴索能降低細胞內白介素-6（IL-6）、組織金屬蛋白酶抑制因子1（TIMP-1）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子以及促使肺泡表面活性PS物質的合成減輕百草枯造成的急性肺損傷[3]。氨溴索能降低百草枯中毒所致的早期急性肺損傷，但其抑制百草枯中毒后期的肺纖維化效果以及相關的機制還不清楚。研究表明細胞因子IL-6、TIMP-1和TNF-α參與了肺纖維化的發展[4-7]。因而，本研究觀察不同劑量氨溴索干預對急性百草枯中毒大鼠肺損傷后肺纖維化的影響并闡述其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑、藥品及儀器

105只6周齡、體重250～310 g的SPF級SD雄性大鼠購自溫州醫科大學實驗動物中心[合格證號：SCXK（浙）2010-0044]。本研究經溫州醫科大學附屬黃巖醫院倫理委員會批準。按常規飼養條件，在氨溴索干預后第21天，予腹腔注射2%利多卡因2 mL處死大鼠。主要試劑及藥品：氨溴索（批號：20090043），德國柏林格殷格翰醫藥公司；脂質體、熒光素酶活性檢測試劑盒，美國Promega公司；Trizol試劑、逆轉錄試劑，Invitrogen公司；TaqMan miRNA檢測試劑盒，美國ABI公司；TIMP-1抗體（批號ESAP10803）TNF-α抗體（批號110520），美國Novus Biologicals公司；實時熒光定量9700 PCR分析儀，美國ABI公司產品。

1.2 動物分組及百草枯中毒模型建立

根據隨機數字表分組原則，105只大鼠隨機分為5組，即：正常對照組（NC組）5只，百草枯中毒組（PQ組）、氨溴索普通劑量治療組（PN組）、氨溴索大劑量治療組（PL組）以及氨溴索超大劑量治療組（PE組）各25只。NC組按1.25 mg/kg一次性腹腔注射生理鹽水；PQ組：按25 mg/kg一次性腹腔注入2%PQ液，建立大鼠PQ中毒模型；氨溴索治療組：在PQ中毒模型成功后分別給予腹腔注射氨溴索，劑量分成30 mg/（kg·d）、50 mg/（kg·d）以及90 mg/（kg·d）。本研究根據前期實驗結果及既往研究結果[8]，30 mg/（kg·d）組染毒后21 d大鼠行為、體重的變化及肺組織纖維化的病理改變，均符合百草枯中毒的特征，且在觀察期內未出現死亡，故以30 mg/（kg·d）的劑量作為建立模型的合適劑量。以出現飲食明顯減少，靜伏少動，逐漸出現目光呆滯，反應遲鈍，尿量減少，甚至明顯呼吸急促等典型的百草枯中毒的特征作為建模成功的標準。

1.3 BALF以及肺組織的收集

處死大鼠后完整取出肺臟，氣管分叉處結扎右主支氣管，取出右肺組織，保存在-80℃冰箱以備用mRNA和蛋白測定；左肺給予冰生理鹽水灌洗（2.5 mL×3次），回收BALF，進行低溫離心（2500 r/min，離心3～5 min），取上清液，保存在-80℃度冰箱以備用；后左肺以10%中性甲醛溶液固定。

1.4 ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-6的濃度

取出上述BALF標本上清，ELISA法檢測BALF中IL-6的濃度，操作具體按試劑盒說明進行。

1.5 HE染色半定量評價肺損傷程度及Masson染色評價肺纖維化程度

甲醛溶液固定的左肺組織，分別進行HE染色及Masson染色。采用Mikawa評分[7]方法：①肺泡充血；②出血；③間隙或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集；④肺泡間隔增厚或透明膜形成。按病變輕重，分為0～4分（0分為無或極輕微損傷；1分為輕度損傷；2分為中度損傷；3分為重度損傷；4分為極重度損傷），總分作為病理評分。

Fulmer評分[8]來半定量肺纖維化：0級，無纖維化，得0分；Ⅰ級：輕度纖維化，受累面積<10%，得1分；Ⅱ級：中度纖維化，病變范圍占全肺的10%～25%，得2分；Ⅲ級：重度纖維化，病變范圍占全肺的26%～40%，得3分；Ⅳ級：極重度纖維化，病變范圍>40%，得4分；每組切片觀察4個高倍鏡，最后取平均值為肺纖維化得分。

1.6 qRT-PCR法檢測肺組織TNF-α和TIMP-1的mRNA表達

運用qRT-PCR法檢測右肺組織中TNF-α和TIMP-1的mRNA表達，具體按試劑盒說明進行。TNF-α和TIMP-1表達的相對值=2-△△Ct。TNF-α引物：（F）5'-GTAGCCCACGTCGTAGCAAAC-3'和（R）5'-TGT？鄄GGGTGAGGAGCACATAG-TC-3'；TIMP-1引物：（F）5'-ATCGCTCTGGTAGCCCTTCT-3'和（R）5'-TCCCA？鄄GA- AATCATCGAGAC-3'。以U6為內參，每組實驗重復3次。

1.7 Western blot檢測組織TNF-α和TIMP-1蛋白的表達

采用Western blot檢測右肺組織中TNF-α和TIMP-1蛋白的表達情況，具體按試劑盒說明進行。以目的蛋白與內參β-actin的灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.8 統計學方法

采用統計軟件SPSS 19.0對數據進行分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

研究中除NC組外，各組大鼠均出現不同程度典型的百草枯中毒的特征，各組實驗過程中均無大鼠死亡。

2.1 氨溴索干預對大鼠肺損傷及肺纖維化的影響

HE染色結果（圖1A，封三）顯示：NC組大鼠肺組織形態學未見明顯改變，而PQ組肺炎性損傷改變明顯。與模型組相比，PN組降低了肺損傷程度，但無統計學意義；PL組和PE組均不同程度減輕肺損傷程度（P < 0.05）。見表1。

Masson染色結果（圖1B，封三）顯示，在NC組肺組織中基本沒有膠原沉積，PQ組表達最高；氨溴索治療后均不同程度的降低（P < 0.05）；在氨溴索治療組中，與PN組相比，PL組和PE組更能夠降低Fulmer評分（P < 0.05）。見表1。

2.2 氨溴索對百草枯中毒肺纖維化SD大鼠BALF中IL-6表達的影響

ELISA結果顯示：各實驗組IL-6的濃度均有不同程度升高 （P < 0.05），PL組和PE組能明顯降低百草枯中毒所導致的IL-6的水平（P < 0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠TNF-α、TIMP-1 mRNA與蛋白的表達

Western blot結果表明，各實驗組TNF-α和TIMP-1的mRNA與蛋白表達均顯著升高（P < 0.05）；各劑量氨溴索均能顯著降低TNF-α和TIMP-1的表達（P < 0.05）；在PL組和PE組兩組中，TNF-α和TIMP-1的表達無統計學意義（P > 0.05）。見表3。

3 討論

百草枯中毒大鼠肺的病理改變包括早期急性肺炎和后期肺纖維化，炎性細胞的浸潤和炎性因子的釋放是其重要的病理特征，IL-6、TNF-α和TIMP-1等細胞因子在肺纖維化的發病及病理過程中的作用已引起廣泛的重視[4，9]。筆者發現，在百草枯中毒后第21天后，大鼠肺組織不僅存在肺損傷，同時伴有肺組織大量膠原沉積，并伴有TIMP-1、TNF-α和IL-6表達的增加，這與Nakamura等[10]的研究是一致的，說明百草枯中毒后期出現廣泛的肺纖維化。

鹽酸氨溴索具有抗炎、抗氧化和促進肺泡表面活性物質釋放等作用，能夠減輕放射性、內毒素等所致的急性肺損傷[11-12]。本研究主要發現，氨溴索能夠減輕百草枯中毒所導致的肺損傷和肺膠原的沉積，同時降低TIMP-1、TNF-α和IL-6的水平，提示氨溴索對于百草枯中毒所致的急性肺損傷及后期的纖維化有一定的保護作用。

TNF-α與肺纖維化和肺間質炎癥密切相關，在肺纖維化中起重要作用[13-14]。IL-6具有廣泛的生物學功能，在肺纖維化過程中，大量增生的淋巴細胞、巨噬細胞以及成纖維細胞可以產生大量的IL-6，導致IL-6水平的升高[15-17]。本研究發現氨溴索能夠降低TNF-α和IL-6的表達，提示氨溴素對百草枯中毒所致的后期肺纖維化的保護作用可能與這兩個細胞因子相關。

急性百草枯中毒患者由肺損傷漸進發展為肺間質纖維化，其發生發展與TIMP-1的表達相關，研究結果顯示百草枯中毒后導致TIMP-1水平升高，考慮為中毒后肺泡內皮、上皮細胞受損，釋放一系列細胞因子和炎性遞質，促進基質金屬蛋白酶合成與活化，從而參與細胞外基質和基底膜的降解，導致急性肺損傷[18-20]。而中毒后期，TIMP-1仍持續高于正常，此時，TIMP-1的表達占優勢，參與肺纖維化的進展[21-22]。本研究發現肺纖維化程度越高，TIMP-1的表達越高，而氨溴索干預后可以明顯降低TIMP-1的表達。

綜上所述，本研究發現氨溴索能夠減緩急性百草枯中毒引起的肺損傷及肺組織纖維化，這種作用與TIMP-1、TNF-α以及IL-6相關。因而，氨溴索對急性百草枯中毒引起的肺損傷及肺纖維化有一定的保護作用，值得進一步研究。

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（收稿日期：2016-11-24 本文編輯：蘇 暢）