受體相互作用蛋白3對神經膠質瘤U251細胞增殖的影響

于澤奇+武慧麗+涂悅+衣泰龍+楊小颯+張賽+程世翔

[摘要] 目的 探討受體相互作用蛋白3（RIP3）在神經膠質瘤細胞中的表達及其對U251細胞增殖的影響。 方法 采用實時定量PCR（real-time RT-PCR）法分別檢測神經膠質瘤A172、U251、U373和U87細胞中RIP3的表達水平，隨后應用U251穩定過表達RIP3（U251-RIP3）細胞模型，分別采用MTT法和克隆形成實驗檢測細胞增殖能力，流式細胞儀評價細胞周期變化。結果 RIP3 mRNA在4株膠質瘤細胞（A172、U251、U373、U87）中均有表達，并在U251細胞中表達最低。real-time RT-PCR結果表明U251-RIP3細胞中穩定過表達RIP3，與陰性對照（空載）（NC）相比，RIP3過表達能夠抑制U251細胞增殖能力；能夠降低U251細胞克隆形成能力，培養11 d后細胞集落數目（67±2）較NC（75±3）減少（P < 0.05）；能夠延緩細胞周期進程，U251-RIP3細胞的S期比例較NC組（16.0±0.4）%升至（18.2±1.0）%（P < 0.05），同時G0/G1期比例較NC組（55.7±0.5）%降至（57.4±0.4）%（P < 0.01）。 結論 RIP3過表達后可抑制神經膠質瘤U251細胞增殖，有望成為靶向控制膠質瘤細胞增殖的潛在治療靶點。

[關鍵詞] 受體相互作用蛋白3；膠質瘤；細胞增殖；可控性壞死

[中圖分類號] R739.41 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（a）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the expressive changes of RIP3 in all sorts of glioma cell lines and the effects on the cell proliferation in the U251 cells. Methods The expression levels of RIP3 mRNA in the four glioma cell lines （A172， U251， U373 and U87） were firstly selected by real-time RT-PCR. Then， U251 cells were engineered to overexpress RIP3 for further study. Lastly， the MTT， colony formation， and flow cytometry assays were used to detect the effects of RIP3 on the cell proliferation， clone formation， and cell cycle of U251 cells， respectively. Results The expression levels of RIP3 mRNA was detected in all four glioma cell lines， and the lowest level of it was discovered in U251 cell line. Then， real-time RT-PCR assay showed that RIP3 was successfully overexpressed in U251-RIP3 cells compared with negative control （NC） cells with empty vector. The overexpressed RIP3 altered the cell viability in U251 cells， Additionally， the overexpressed RIP3 also reduced the colony formation of U251 cells： after 11 d of cell culture， the colony number of U251-RIP3 cells （67±2） was significantly decreased compared with that of NC cells （75±3） （P < 0.05）. Correspondingly， the proportion of U251-RIP3 cells in S phase arrest was higher than that in NC cells [from （16.0±0.4）% to （18.2±1.0）% ] （P < 0.05）. Meanwhile， that in G0/G1 phase was reduced compared with that in NC cells [from （57.4±0.4）% to （55.7±0.5）%] （P < 0.01）. Conclusion Studies suggested that the overexpression of RIP3 could confer inhibition to the cell proliferation in glioma U251 cells； and it indicated that RIP3 may be as a potential target for glioma chemotherapy.

[Key words] Receptor-interacting protein 3； Glioma； cell proliferation； Regulated necrosis

腦腫瘤占中樞神經系統腫瘤的90%以上[1]，而神經膠質瘤（gliomas）是最常見的腦腫瘤。近20年來，膠質瘤患者中位生存期無明顯改善，其高復發率成為治療的最大難題[2]。隨著醫學的飛速發展，使我們對腫瘤的發生機制有了更深入的了解，同時也提供了腫瘤治療的新策略和新手段，其中基因治療被認為是前景廣闊的一種治療方式，已成為神經科學中最富挑戰而又亟待解決的課題。

受體相互作用蛋白3（receptor-interacting protein 3，RIP3）是受體相互作用蛋白家族（RIPs）的重要成員。激活狀態下的RIP3 能夠調控細胞可控性壞死以及炎癥的發生[3]。研究表明，RIP3在丘腦、黑質、胼胝體、殼核、延髓和脊髓中呈現高表達水平，提示RIP3可能在神經系統發育和疾病進程中扮演著重要角色[4]。近年來，RIP3在多種腫瘤（例如肝癌、肺癌、膠質瘤等）中發揮的重要作用受到廣泛關注[5-7]，然而，RIP3對腫瘤細胞的功能影響尚存在爭議。本研究旨在探討RIP3在各種神經膠質瘤細胞中的表達情況及其對膠質瘤細胞生物學功能的影響，為其在膠質瘤治療中的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株

膠質瘤細胞株A172、U251、U373、U87購自美國ATCC公司，常規用含10%胎牛血清的DMEM培養基，于37℃、5% CO2培養箱中常規培養。

1.2 儀器與試劑

CO2恒溫三氣培養箱（150i，美國Thermo），倒置顯微鏡（TS100-LED MV，日本Nikon），Real time PCR 儀器（LightCycler 480 II，德國Roche），酶標儀（1510，美國Thermo），流式細胞儀（FACSCallibur，美國BD）；Trizol試劑（美國Invitrogen），M-MLV、dNTPs（美國Promega），oligo dT（上海生工），RNAase Inhibitor（美國Promega），Primer（上海生工），SYBR？誖 Premix Ex Taq（大連寶生物工程有限公司），MTT、DMSO、Giemsa染色液、PI（美國Sigma），RNase A（康為世紀公司），凋亡試劑盒（美國eBioscience）。

1.3 引物設計和RIP3重組載體構建

RIP3基因上游引物：5′-TGG CGG TCA AGA TCG TAA ACT C-3′，下游引物5′-TTC TGG TCG TGC AGG TAA AAC A-3′，長度265 bp；GAPDH基因上游引物：5′-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3′，下游引物5′-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3′，長度121 bp。采用Age I和EcoR I酶切目的片段和慢病毒載體（GeneChem），通過T4 DNA連接酶將其在NE Buffer中16℃連接過夜，轉化DH5α感受態并涂板。PCR鑒定陽性重組子，DNA測序驗證后，轉染293T細胞48 h。收集上清液，經濃縮過濾后獲得濃縮病毒液，分裝，-80℃保存。

1.4 real-time RT-PCR法檢測RIP3 mRNA表達水平

用Trizol試劑盒提取四株膠質瘤細胞總RNA，使用M-MLV試劑盒將其反轉錄成cDNA，反應條件：42℃水浴反應1 h，70℃水浴10 min使逆轉錄酶失活，將得到的cDNA置于-20℃保存備用。再以此cDNA為模板進行real-time RT-PCR，擴增條件：95℃預變性5 min，95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，40次循環，72℃ 10 min。RIP3基因相對表達量用2-ΔΔCt 方法計算。

1.5 U251細胞穩定轉染

取對數生長期的U251細胞，按（3～5）×104個/mL接種于細胞培養瓶中，待融合度約為40%時更換含有RIP3慢病毒載體的維持液，維持液中感染復數（MOI）為10、16 h后將各孔中細胞收集到干凈的1.5 mL EP管中，2000 r/min離心2 min，去掉上清液，更換為完全培養基，輕輕混勻后繼續培養。感染后72 h更換含濃度為2 μg/mL的嘌呤霉素培養基篩選細胞，細胞存活即為陽性感染。實驗分設U251-RIP3和陰性對照（空載）（NC）。

1.6 MTT法檢測細胞增殖

取對數生長期的U251細胞，按每孔2000個接種于96 孔板中，置于細胞培養箱中持續培養1、2、3、4、5 d。檢測時間點終止前4 h加入20 μL 5 mg/mL的MTT于孔中，無需換液。4 h后完全吸去培養液，加100 μL DMSO溶解甲瓚顆粒。振蕩器振蕩2～5 min，酶標儀490 nm檢測OD值。

1.7 細胞克隆形成實驗

取對數生長期的U251細胞，按每孔細胞1000個接種于6孔板中，待細胞貼壁后2 h，在孔內分別加入等體積的DMEM培養基，于培養箱內孵育11 d后，用PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定細胞60 min，洗滌后每孔加入Giemsa染液500 μL，染色30 min，洗滌晾干后拍照計數。

1.8 細胞周期分析

收集各組U251細胞，1000 r/min離心5 min后，棄上清，加入預冷PBS液4 mL，反復吹打，1000 r/min再離心5 min。反復沖洗3次后，用75%冰乙醇固定細胞，-20℃過夜。將固定好的細胞用PBS洗滌離心后，再用500 μL PBS將細胞重懸，分別加入50 μg/mL碘化丙啶（PI）和100 μg/mL RNase A。37℃避光孵育30 min后，用流式細胞儀進行檢測，每組實驗重復3次。

1.9 統計學方法

采用Graphpad Prism 6.0軟件進行數據分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間數據的比較采用非配對樣本t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 U251-RIP3穩定轉染細胞模型的建立

采用real-time RT-PCR法檢測了RIP3 mRNA在4株人腦膠質瘤細胞（A172、U251、U373和U87）中的表達水平，結果顯示（圖1A），U373細胞中RIP3 mRNA表達水平最高，而U251細胞表達最低。為此，本實驗選擇U251細胞為模型，通過構建的RIP3過表達重組載體穩定轉染U251細胞，結果表明（圖1B），與NC比較，U251-RIP3組中RIP3表達顯著升高（P < 0.01），提示U251-RIP3穩定轉染細胞系構建成功。

2.2 過表達RIP3降低U251細胞增殖能力

采用MTT法檢測RIP3對U251細胞增殖能力的影響，結果顯示：在檢測的各個時間點，U251-RIP3 細胞生長速度明顯低于NC[1 d：（0.15±0.00）比（0.20±0.00），2 d：（0.24±0.01）比（0.35±0.01，3 d：（0.40±0.05）比（0.565±0.06），4 d：（0.59±0.08）比（0.89±0.07），5 d：（1.33±0.07）比（1.57±0.08）； P < 0.01或P < 0.05。見圖2]，提示RIP3能夠抑制U251細胞增殖。

2.3 過表達RIP3降低U251細胞克隆形成能力

采用細胞克隆形成實驗檢測RIP3對U251細胞克隆形成能力的影響。結果表明，培養11 d后，U251-RIP3 細胞集落數目（67±2）較NC（75±3）減少（P < 0.05，圖3A），而且形成的集落中細胞數目減少（圖3B），提示RIP3能夠降低U251細胞的克隆形成能力。

2.4 過表達RIP3延緩U251細胞周期進程

采用流式細胞術評價RIP3對U251細胞周期的影響（圖4）。與NC比較（表1），U251-RIP3組細胞可降低G0/G1期細胞比例，由（57.4±0.4）%降至（55.7±0.5）%（P < 0.01），同時升高S期細胞比例，由（16.0±0.4）%升至（18.2±1.0）%（P < 0.05），而G2/M期變化無差異，提示RIP3使U251細胞阻滯于S期，延緩細胞周期進程，抑制U251細胞增殖。

3 討論

近年來研究研究表明，腫瘤的發生、進展和耐藥與腫瘤細胞的可控性壞死密切相關[3]。傳統觀點認為，壞死是在強烈的外界刺激下發生的被動病理過程。后續研究證實，細胞壞死可受死亡信號通路的調控，2005年Degterev等[8]首次將這種可受調控的細胞壞死稱為壞死性凋亡（necroptosis），其中RIP3是壞死性凋亡通路中的核心分子。

RIP3是受體相互作用蛋白家族的成員之一，具有特異的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，其獨特的C端能夠感受細胞內環境變化，精細調控細胞死亡和存活[9]。另有文獻報道，RIP3在腦、心、肝、腎等正常組織中均有廣泛表達[10]，而在肝癌、肺癌等內都是低表達狀態[11-12]，而且RIP3多定位于腫瘤相關的染色體14q11.2區[13]，這提示RIP3可能與腫瘤細胞的生物學功能聯系密切。為此，本實驗首先利用慢病毒載體構建RIP3穩定過表達U251細胞株。該方法具有較高的轉導效率，能感染分裂期或非分裂期細胞，可將外源RIP3基因整合入U251細胞中得到穩定表達，是基因治療中強有力的工具。

目前研究認為，神經膠質瘤的發生發展與細胞增殖與死亡平衡功能失調有關，研究發現RIP1-RIP3復合體能夠調控放療誘導的膠質瘤細胞可控性壞死的發生[14]。然而，另有報道顯示，RIP1、RIP3卻在乳腺癌細胞增殖中扮演了促進角色[15]，這提示RIP3介導腫瘤細胞壞死性凋亡可能在不同類型腫瘤中發生“雙刃劍”作用。為此，本實驗旨在探討RIP3在神經膠質瘤細胞增殖中所發揮的作用。結果表明，過表達RIP3能夠降低U251細胞增殖能力、降低細胞克隆形成、延緩細胞周期進程。

綜上所述，本實驗首次證實RIP3在不同膠質瘤細胞中的表達水平，并深入探討了過表達RIP3在U251細胞中的生物學功能，這為臨床靶向治療膠質瘤提供了新的理論和實驗依據。

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（收稿日期：2017-01-15 本文編輯：蘇 暢）