少腹逐瘀湯對子宮內膜異位癥模型大鼠在位內膜增殖、凋亡及血管生成的影響

陳雨詩，朱廣輝，董建新，白素芬，杜晨光，曹穎

(1.華北理工大學，河北 唐山 063000； 2.華北理工大學 附屬醫院，河北 唐山 063000)

·論 著·

少腹逐瘀湯對子宮內膜異位癥模型大鼠在位內膜增殖、凋亡及血管生成的影響

陳雨詩1，朱廣輝1，董建新2，白素芬1，杜晨光1，曹穎1

(1.華北理工大學，河北 唐山 063000； 2.華北理工大學 附屬醫院，河北 唐山 063000)

目的：觀察少腹逐瘀湯對子宮內膜異位癥模型大鼠在位內膜增殖、凋亡及血管生成的影響，探討少腹逐瘀湯治療子宮內膜異位癥的機制。方法：58只SD雌性大鼠中隨機選擇10只作為對照組，剩余大鼠采用自體移植法建立子宮內膜異位癥大鼠模型，造模成功的38只大鼠隨機分為模型組及治療組，治療組給予少腹逐瘀湯灌胃，給藥4周。HE染色觀察在位內膜組織形態及內膜厚度，免疫組化法檢測PCNA表達，TUNEL法檢測細胞凋亡，免疫熒光雙標法檢測CD34、SMA- α表達以評估微血管密度(MVD)及血管成熟指數(VMI)。結果：模型組在位內膜較對照組、治療組明顯增厚(P<0.05)，在位內膜凋亡指數明顯低于對照組及治療組(P<0.01)，MVD值明顯高于對照組及治療組(P<0.05)，VMI值明顯低于對照組及治療組(P<0.01)。結論：少腹逐瘀湯可以通過誘導子宮內膜異位癥模型大鼠在位內膜間質細胞凋亡來抑制在位內膜增殖，并能夠抑制在位內膜血管生成，促進微血管成熟。

少腹逐瘀湯； 子宮內膜異位癥； 細胞增殖； 細胞凋亡； 血管生成； 大鼠

子宮內膜異位癥(endometriosis, EMT)是一種子宮內膜腺體和間質種植于子宮腔以外的雌激素依賴性疾病，在育齡期女性中的發病率為10%，在不孕癥患者中的發病率高達25%～50%[1]。越來越多的證據表明，EMT患者的在位內膜與非EMT患者的子宮內膜在組織學及分子生物學特征上存在明顯不同。這些功能異常的子宮內膜具有更強的腹腔種植潛能。也就是說，在位內膜的病變在EMT發病中起著至關重要的作用[2]。在對狒狒及嚙齒類動物EMT模型的研究中發現，造模導致在位內膜在細胞侵襲、血管生成、細胞生長、免疫調節、性激素代謝等方面的蛋白表達異常，說明異位病灶影響了在位內膜的生物學特征。這可能與炎癥反應干擾了性激素受體表達或子宮內膜細胞的表觀遺傳學特征有關[3]。另有研究證據表明，異位病灶細胞可以遷移至在位內膜[4]。以上研究表明，在位內膜功能異常與異位病灶形成之間互為因果，相互影響。

如果針對EMT的治療藥物可以糾正在位內膜的病理狀態，將可能有助于EMT治療。在EMT治療中被廣泛使用的促性腺激素釋放激素激動劑(gonadotropin releasing hormone agonist, GnRHa )即被證實能夠抑制在位內膜中的血管新生及細胞增殖，誘導在位內膜發生細胞凋亡[5- 6]。然而，GnRHa以降低人體雌激素水平為代價，隨之而來的各種副作用限制了藥物的長期應用。中醫藥療法因治療效果與達那唑或孕三烯酮類似，但不抑制排卵[7]，副作用更少，能更好地改善全身癥狀[8]，在EMT的治療中被廣泛使用。以活血化瘀、溫經止痛立法的經典名方少腹逐瘀湯是治療寒凝血瘀型EMT的常用方劑。少腹逐瘀湯對EMT的治療是否與糾正在位內膜病理狀態有關呢？本研究從在位內膜的細胞增殖、凋亡及血管生成入手，初步揭示少腹逐瘀湯對EMT的治療作用及其機制，旨在為其在EMT治療中的應用提供新證據、新思路。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級SD大鼠60只，雌性，體質量(200±20) g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，動物合格證號：SCXK- (軍)2014- 0001。

1.2 藥物

少腹逐瘀湯：根據王清任《醫林改錯》原方所載的藥味及配方比例，處方：當歸9 g，生蒲黃9 g，五靈脂6 g，赤芍6 g，小茴香3 g，醋延胡索3 g，沒藥3 g，川芎3 g，肉桂3 g，炮姜0.6 g。以上藥物均購于北京同仁堂唐山連鎖藥店有限公司。藥物制備采用傳統煎煮方法，除肉桂外其他藥物加水300 ml 先浸泡1 h，煮沸，文火煎煮60 min，肉桂后下，煎煮20 min；濾出藥液，濃縮至1 g·ml-1。

1.3 主要試劑及儀器

一抗PCNA小鼠單克隆抗體(批號610664，美國BD公司)，一抗CD34兔單克隆抗體(ab81289，美國Abcam公司)，一抗SMA- α小鼠單克隆抗體(ab7817，美國Abcam公司)，二步法免疫組化檢測系統(PV- 900，北京中杉金橋生物技術有限公司)，熒光二抗Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG(ab150077，美國Abcam公司)，熒光二抗Alexa Fluor 594標記的山羊抗小鼠IgG(ab150116，美國Abcam公司)，Apop Tag過氧化物酶標記的原位細胞凋亡檢測系統(S7100，美國Chemicon公司)，DAB(0031，福州邁新生物技術開發有限公司)，顯微鏡(奧林巴斯BX53)。

1.4 方法

1.4.1 動物造模

60只大鼠常規適應性喂養1周后每日定時作陰道涂片檢查，選擇動情周期4～5 d，并連續有兩個正常動情周期的大鼠共計58只。隨機選取10只作為對照組，正常飼養。剩余48只大鼠在動情期造模[9- 10]，造模前24 h給予戊酸雌二醇0.2 mg·只-1灌胃，造模時以2%戊巴比妥鈉按40 mg·kg-1對大鼠進行麻醉。在無菌條件下選取尿道口上端約1 cm處為切入點，沿腹中線切開1.5～2.0 cm的縱形切口，進入腹腔后分離并結扎右側子宮，取中間段約1.5 cm，縱形剪開宮腔，切取5 mm×5 mm大小的子宮組織，生理鹽水沖洗后將子宮組織以內膜面貼向左側腹膜血管豐富處，用5- 0非吸收性縫合線縫合子宮組織四角，關腹。術后連續3 d給予腹腔注射青霉素鈉，術后第10天起灌胃戊酸雌二醇0.02 mg·只-1，連續5 d。造模后第4周陸續選擇動情期大鼠剖腹檢查，見移植的子宮內膜體積增大，呈透明的結節狀或囊狀，內有液體積聚，表面有結締組織覆蓋及血管形成，為造模成功。

1.4.2 動物分組及干預

經剖腹檢查證實造模成功的大鼠共計38只，隨機分為模型組及治療組，每組19只。治療組給藥量按人體正常給藥量46.6 g·d-1，根據大鼠體表面積換算為大鼠給藥量，模型組及對照組灌胃等體積生理鹽水，每周根據大鼠體質量變化調整灌胃量，連續灌胃4周。藥物干預期間模型組有1只大鼠死于灌胃意外，治療組有1只大鼠因咬傷死亡。

1.4.3 指標檢測

1.4.3.1 大鼠子宮組織形態學觀察 將大鼠子宮及異位內膜組織用10%甲醛溶液固定48 h，經梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，常規HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.4.3.2 免疫組化法檢測增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表達 二甲苯和梯度酒精對組織切片進行脫蠟、水化，0.3%的H2O2室溫孵育10 min去除過氧化物酶，山羊血清37 ℃封閉30 min，一抗稀釋濃度為1∶50，4 ℃孵育過夜。二抗孵育參照試劑說明書進行操作。DAB顯色，蘇木素復染、脫水、透明、中性樹膠封片。每張切片在400倍鏡下隨機選擇5個視野進行拍照，采用ImageProPlus6.0軟件分析細胞增殖指數，增殖指數(‰)=增殖細胞數/總細胞數×1000。

1.4.3.3 末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnickendlabeling,TUNEL)檢測細胞凋亡 嚴格按照試劑盒說明書進行操作，每張切片在400倍鏡下隨機選擇5個視野進行拍照，采用ImageProPlus6.0軟件分析細胞凋亡指數，凋亡指數(%)=凋亡細胞數/總細胞數×100。

1.4.3.4 免疫熒光雙標法檢測CD34、平滑肌肌動蛋白α(α-smoothmuscleactin,SMA-α)蛋白表達 二甲苯和梯度酒精對組織切片進行脫蠟、水化，山羊血清37 ℃封閉30min，一抗稀釋濃度為1∶200，4 ℃孵育過夜。二抗孵育參照試劑說明書進行操作，DAPI染核，每張切片在200倍鏡下隨機選擇3個視野進行拍照，采用ImageProPlus6.0軟件分析微血管密度(microvesseldensity,MVD)、SMA-α陽性MVD及血管成熟指數(vascularmaturityindex,VMI)。MVD=CD34陽性血管計數/視野面積，VMI(%)=SMA-α陽性MVD/MVD×100。

1.5 統計學處理

采用SPSS22.0進行統計學分析。實驗數據以均數±標準差進行描述；符合正態分布的多組數據比較，采用單因素方差分析one-wayANOVA；不符合正態分布的多組數據比較，采用Kruskal-WallisH檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 少腹逐瘀湯對在位內膜組織形態學及內膜厚度的影響

病理結果顯示，對照組子宮內膜規整，間質內腺體完整、排列整齊，間質細胞疏松排列整齊；模型組子宮內膜增厚，間質內腺體管腔不規則，部分管腔消失，間質細胞致密，炎癥細胞增多；治療組間質內腺體管腔完整，形態較規則，間質細胞排列整齊，但較對照組更為密集，可見少量炎癥細胞。各組大鼠子宮內膜組織圖片見圖1。對照組大鼠在位內膜厚度為(475.00±29.43) μm，模型組在位內膜明顯增厚達(523.60±33.32) μm，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組大鼠在位內膜為(458.25±19.43) μm，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)；治療組與對照組在位內膜厚度比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 少腹逐瘀湯對在位內膜細胞增殖、凋亡的影響

3組大鼠在位子宮內膜腺上皮及間質細胞中PCNA表達均較低，各組間細胞增殖指數比較差異無統計學意義(P>0.05)。在位內膜間質細胞凋亡較腺上皮明顯，其中對照組及治療組內膜間質細胞凋亡指數高于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)，對照組與治療組比較差異無統計學意義(P>0.05)；3組大鼠在位內膜腺上皮細胞凋亡指數比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表1。

2.3 少腹逐瘀湯對在位內膜血管生成的影響

模型組MVD值高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，治療組MVD值低于模型組及對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。治療組SMA- α陽性MVD低于對照組(P<0.01)。模型組VMI值顯著低于對照組及治療組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3、表2。

A.對照組；B.模型組；C.治療組

圖1 各組大鼠子宮內膜 HE染色×100

Fig 1 HE staining of endometrium of different groups of rats ×100

A1- 2.對照組；B1- 2.模型組；C1- 3.治療組

圖2 各組大鼠子宮內膜PCNA、TUNEL表達 ×400

Fig 2 Expressions of PCNA and TUNEL in endometrium of different groups of rats ×400

表1 各組大鼠在位內膜細胞增殖指數及凋亡指數比較

Tab 1 Comparisons of proliferative and apoptotic index in endometrium of different groups of rats

組 別在位內膜間質在位內膜腺上皮增殖指數/‰凋亡指數/%增殖指數/‰凋亡指數/%對照組16．26±10．8536．95±6．89a5．51±8．638．63±4．48模型組8．68±5．9322．94±9．727．75±11．826．09±4．61治療組13．62±12．3134．76±5．77a3．12±4．7110．75±8．89

a 與模型組比較，P<0.01

A1- 4.對照組；B1- 4.模型組；C1- 4.治療組；綠色為CD34標記的微血管，紅色為SMA- α標記的微血管，藍色為DAPI標記的細胞核

圖3 各組大鼠子宮內膜CD34、SMA- α免疫熒光染色 ×200

Fig 3 Expressions of CD34 and SMA- α in endometrium of different groups of rats ×200

表2 各組大鼠在位內膜MVD、SMA- α陽性血管密度、VMI水平的比較

Tab 2 Comparisons of MVD, SMA- α positive MVD and VMI in endometrium of different groups of rats

組 別MVD/個·mm-2SMA?α陽性血管密度/個·mm-2VMI水平/%對照組91．78±5．50a88．92±11．6296．67±9．43b模型組127．01±29．9273．49±21．4457．78±10．32治療組70．17±12．91bc65．72±10．95c95．08±13．93b

與模型組比較， aP<0.05，bP<0.01； c 與對照組比較，P<0.01

3 討 論

在EMT的諸多發病學說中，Sampson的經血逆流理論居于主導地位。近年來，在位內膜異常在EMT發病中的作用日益受到重視。郎景和院士提出的“在位內膜決定論”正是基于對EMT患者在位內膜研究的成果所提出的病因假說。本研究發現，在動情期EMT模型大鼠子宮內膜的厚度大于對照組，而治療組子宮內膜厚度小于模型組，與對照組比較無統計學差異，說明EMT造模改變了子宮內膜微環境，促進了在位內膜增殖。余燚薇等[11]比較EMT患者與非EMT患者增殖期、分泌期在位內膜厚度發現，EMT患者在位內膜明顯增厚；在EMT保守治療后3年隨訪期間，42.11%的復發患者于復發前出現在位內膜增厚；據此認為EMT患者在位內膜厚度與疾病發生、復發密切相關，本研究結論與之一致。

大鼠子宮內膜厚度的變化與內膜細胞的增殖、凋亡直接相關。本研究中以PCNA作為檢測細胞增殖的標志。PCNA主要表達于細胞周期的S期，位于細胞核內，是DNA聚合酶δ的輔助蛋白，為DNA復制所必需，可作為研究細胞增殖的有效標志。本研究顯示，各組大鼠在位內膜增殖均不明顯，組間比較差異無統計學意義，這是由于大鼠的動情期與女性月經周期中的黃體期類似。在動情期，大鼠子宮內膜的增殖被抑制，核分裂及PCNA指數水平均處于動情周期中的最低值[12]。因此，由于取材時間的局限，研究數據并不能全面反映細胞增殖對在位內膜厚度的影響。研究中選用TUNEL方法監測細胞凋亡，結果顯示模型組在位內膜間質細胞的凋亡指數明顯低于對照組及治療組，說明模型組大鼠在位內膜增厚可能與間質細胞抗凋亡能力增強有關，而少腹逐瘀湯能夠誘導在位內膜間質細胞凋亡。對EMT患者經血及分泌晚期、月經期子宮內膜標本的研究均顯示，在位內膜凋亡指數顯著高于正常子宮內膜。這一變化使得逆流經血中的子宮內膜碎片中具有更多的活細胞，由于這些細胞中抗凋亡因子B淋巴細胞瘤- 2(B- cell lymphoma- 2, bcl- 2)表達上調，促凋亡因子bcl- 2相關X蛋白(bcl- 2 assaciated X protein, bax)表達下調，細胞對各種凋亡信號的敏感性下降，其發生異位種植的幾率自然更大[13]。而少腹逐瘀湯能夠誘導子宮內膜間質細胞凋亡，使其恢復到正常水平，是否意味著少腹逐瘀湯能通過誘導凋亡起到預防EMT復發的治療作用呢？這一推論需要我們進一步設計實驗加以證實。

血管生成是維持子宮內膜異位種植生長的必要條件，因此抗血管生成被認為是EMT治療藥物的研究方向之一，多項動物實驗結果也顯示出抗血管生成藥物對于EMT具有良好的療效。EMT患者皆為育齡期女性，生理性血管生成是女性生殖功能正常及胚胎發育的先決條件，抗血管生成治療對女性生殖功能的影響是藥物評價中需要解決的問題。促進血管生成的因素眾多，如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血管生成素(angiogenin, Ang)、血小板源性生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)，甚至多種炎癥細胞因子也能誘導血管生成[14]。中藥復方往往通過多層次、多靶點調節發揮抗血管生成作用，因此本研究選擇MVD作為評價血管生成的指標，組織中MVD值越高說明毛細血管越豐富，MVD可以直接反映出藥物抗血管生成的療效。EMT患者在位內膜血管新生活躍，表現為VEGF高表達，MVD值明顯高于正常子宮內膜[3]。血管生成異?；钴S的子宮內膜，其對胚胎的接受能力反而更差[15]，子宮內膜容受性差正是出現EMT不孕的原因之一[16]。綜上所述，糾正在位內膜異常的血管生成狀態將有益于EMT的治療。本研究結果顯示：模型組在位內膜MVD值明顯高于對照組，與以往研究結論[3]一致；少腹逐瘀湯可以抑制在位內膜血管生成。但出人意料的是，治療組的MVD值明顯低于對照組，這一現象是否會影響胚胎著床及發育還需深入研究。周細胞與血管內皮細胞共同構成毛細血管，在維持血管穩定性中發揮著重要作用。新生血管中周細胞覆蓋率偏低是導致血管生成活躍的原因之一[17]。SMA- α是周細胞的主要標志蛋白之一，VMI即微血管的周細胞覆蓋率，是反映微血管成熟度的指標。本研究結果顯示，模型組在位內膜的周細胞覆蓋率明顯低于對照組及治療組。說明異位病灶在促進在位內膜血管生成的同時，還造成了新生血管結構不穩定。這種血管通透性高，更有利于炎癥細胞浸潤[17]。少腹逐瘀湯能夠調控周細胞的生物學行為，促進新生血管成熟，具體機制有待進一步研究。

少腹逐瘀湯作為治療寒凝血瘀型痛經的代表方劑，被諸多中醫婦科名家如季金玲、王大增等作為治療EMT的主方[18- 19]。已有研究表明，少腹逐瘀湯可以改善寒凝血瘀型EMT 大鼠血液流變學指標，降低血清中E2水平[20]，抑制異位病灶中血管新生及異位內膜細胞侵襲[21- 22]。本研究結果表明，少腹逐瘀湯能夠從誘導細胞凋亡、抑制血管新生、促進新生血管成熟3個方面改善EMT大鼠在位內膜的病理狀態，提示其可能具有提高EMT大鼠子宮內膜容受性或降低EMT保守術后復發率的治療作用，為少腹逐瘀湯在EMT治療中的臨床應用提供思路。

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(本文編輯：周蘭波)

Effects of Shao Fu Zhu Yu Decoction on proliferation, apoptosis and angiogenesis in eutopic endometrium of rat endometriosis model

CHEN Yu- shi1,ZHU Guang- hui1,DONG Jian- xin2,BAI Su- fen1,DU Chen- guang1,CAO Ying1

(1.NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China; 2.TheAffiliatedHospital,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective: To observe the effects of Shao Fu Zhu Yu Decoction(SFZY) on proliferation, apoptosis and angiogenesis in eutopic endometrium of endometriosis rats, and to explore the mechanisms of SFZY for treating endometriosis. Methods: 10 rats were randomly assigned to control group from 58 female SD rats, the rest rats underwent surgical induction of endometriosis with autotransplantation. 38 rats with successful ectopic implants were divided into two groups: model group and treated group. SFZY was administered to rats in the treated group by gastrogavage. After a 4- week treatment period, histopathological properties of the eutopic endometrium were evaluated, expression of PCNA in the eutopic endometrium was detected by immunohistochemistry, apoptotic cells were assessed by TUNEL, expression of CD34 and SMA- α in the eutopic endometrium was detected by immunofluorescence double- staining for calculating microvessel density(MVD) and vascular maturity index(VMI). Results: The eutopic endometrium was significantly thicker(P<0.05)in the model group compared to the control and treated group, the apoptosis index and VMI were significantly lower(P<0.01)in the model group compared to the control and treated group, the MVD was significantly increased(P<0.05)in the model group compared to the control and treated group. Conclusion: SFZY can inhibit the proliferation of eutopic endometrium through inducing apoptosis of eutopic endometrial stromal cells in endometriosis rats, and inhibit angiogenesis and induce vessel maturation in eutopic endometrium.

Shao Fu Zhu Yu Decoction; endometriosis; cell proliferation; cell apoptosis; angiogenesis; rats

2016- 09- 28

2016- 12- 09

國家自然科學基金資助項目(81603455)；河北省中醫藥管理局科研計劃項目(2015165)；2015年河北省大學生創新創業訓練計劃項目；2015年華北理工大學大學生創新創業訓練計劃項目(X2015061)

陳雨詩(1993-)，女，遼寧鞍山人，在讀本科生。E- mail:529621925@qq.com

曹穎 E- mail:couny02@163.com

陳雨詩,朱廣輝,董建新,等.少腹逐瘀湯對子宮內膜異位癥模型大鼠在位內膜增殖、凋亡及血管生成的影響[J].東南大學學報:醫學版,2017,36(2):142- 148.

R285.5; R711.71; R- 332

A

1671- 6264(2017)02- 0142- 07

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.003