結締組織生長因子CT結構域的原核表達及分離純化

薛秀蕾，范小波，吳國球

(1.東南大學醫學院，江蘇 南京 210009； 2. 東南大學附屬中大醫院，江蘇 南京 210009)

·論 著·

結締組織生長因子CT結構域的原核表達及分離純化

薛秀蕾1，范小波1，吳國球2

(1.東南大學醫學院，江蘇 南京 210009； 2. 東南大學附屬中大醫院，江蘇 南京 210009)

目的：構建pET32a- TrxA- His- CTGF- CT原核表達載體，實現重組CTGF- CT的可溶性表達及分離純化，以用于制備CTGF- CT抗體。方法：基因合成CTGF- CT序列，利用NcoI和XhoI限制性內切酶雙酶切后插入pET32a載體，構建pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重組質粒，陽性質粒轉化E.colistrain BL21(DE3)細胞，通過異丙基β- D- 硫代半乳糖苷(IPTG)誘導獲得重組融合蛋白，利用鎳柱親和純化及腸激酶酶切純化獲得目的蛋白CTGF- CT，SDS- PAGE鑒定蛋白純度并進行Western blotting分析。結果：所構建pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重組質粒驗證正確。經誘導表達獲得了與預期分子量(28 kD)一致的融合蛋白，融合蛋白經腸激酶切割及兩次鎳柱親和純化獲得目的蛋白CTGF- CT，純化后純度約95%，Western blotting分析表明純化目的蛋白為CTGF- CT。結論：通過構建原核pET32a- TrxA- His- CTGF- CT表達載體實現了重組CTGF- CT蛋白的表達及分離純化，為CTGF- CT抗體的制備和CTGF- CT功能的深入研究打下了基礎。

結締組織生長因子； 原核表達； 蛋白純化

結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)是高度保守的即刻早期基因(CCN)多肽家族成員之一，在細胞增殖、合成膠原、介導細胞黏附和趨化、誘導細胞凋亡、促進血管和肉芽組織形成等多方面均發揮著重要作用[1]。CTGF蛋白有4個功能結構域[2]，依次為胰島素樣生長因子結合蛋白區(IGFBP)、VWF(von willebrand factor)因子的C型重復區(VWC)、血小板反應蛋白I型(TSP- 1)重復區和富含半胱氨酸的C末端(CT區)。其中，CT結構域和受體結合相關[2]。越來越多的研究表明，CT結構域在誘導細胞黏附[3]、調節轉錄[4]、信號通路激活[5- 6]等方面發揮重要的生物學作用。

本研究目的主要是利用基因工程技術構建CTGF- CT原核表達載體表達純化融合蛋白，并經過鎳親和層析純化融合蛋白、腸激酶酶切回收等步驟制備目的蛋白CTGF- CT，經SDS- PAGE、ELISA和Western blotting等分析鑒定所制備的重組CTGF- CT蛋白，為CTGF- CT抗體的制備提供良好的抗原，同時為CTGF- CT的功能研究打下基礎。

1 實驗材料

1.1 載體和菌株

E.colistrain BL21(DE3)菌株購自New England Biolabs公司(Beverly MA,USA)，pET32a質粒載體購自Novagen公司(Madison Wisconsin,USA),pET32a- TrxA- His- CTGF- CT載體由本實驗室構建。

1.2 主要試劑

限制性內切酶(NcoI和XhoI等)及T4 DNA連接酶購自New England Biolabs公司；抗- CTGF單克隆抗體購自R&D SYSTEMS；抗鼠HRP- IgG抗體購自Jackson Imm- unoResearch Laboratories；TRYPTONE(胰蛋白胨)、YEAST EXTRACT(酵母提取物)等發酵培養基成分均來源于OXOID公司；異丙基β- D- 硫代半乳糖(IPTG)、腸激酶、氨芐青霉素、質粒快速提取試劑盒和Ni- IDA親和層析介質來源于南京金斯瑞生物科技有限公司；預染蛋白質標準品來源于Thermo Fisher Scientific；透析袋和超濾管購自Millipore公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究中心；其他試劑均為國產分析純。

2 實驗方法

2.1 CTGF- CT基因的合成及pET32a- CTGF- CT表達載體的構建

利用GenBank檢索并下載人CTGF基因序列(ACCESSION:CR541734.1)，根據其中CTGF- CT序列和大腸桿菌密碼子偏愛性得到cDNA序列，設計PCR引物并基因合成目的CTGF- CT序列，引物F：GATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGAAGAGAACATTAAGAAGGGCAAAA；引物R：AGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATGCCATGTCTCCGTACATCTTC。基因合成產物和pET32a載體用NcoI和XhoI限制內切酶酶切，連接兩個片段組成原核表達載體pET32a- TrxA- His- CTGF- CT。轉化大腸桿菌E.colistrain BL21(DE3)，挑選陽性克隆提取質粒并進行測序驗證。pET32a- CTGF- CT表達載體構建示意圖見圖1。

圖1 pET32a- TrxA- His- CTGF- CT表達載體的構建

2.2 CTGF- CT蛋白的表達及純化

將pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重組質粒轉化至E.colistrain BL21(DE3)感受態細胞，挑取單克隆至5 ml含100 mg·ml-1Amp的LB液體培養基內，37 ℃ 200 r·min-1振蕩培養12 h作為種子液，次日按照1 ∶100的比例接種于200 ml含Amp(100 mg·ml-1)的LB液體培養基內，37 ℃ 220 r·min-1培養2～3 h至OD600值為0.6～0.8，取1 ml培養物作為誘導前對照樣品；向剩余培養物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol·L-1，20 ℃ 160 r·min-1誘導培養8 h，收集菌體。每克濕重的菌體加入5 ml細菌裂解液(100 mmol·L-1NaH2PO4·2H2O,10 mmol·L-1Tris，2 mmol·L-1EDTA，pH 8.0)進行充分懸浮，冰浴下超聲波破碎菌體后4 ℃ 12 000 r·min-1離心20 min，將收集的上清樣品用Ni- IDA親和層柱進行純化獲得融合蛋白(TrxA- His- CTGF- CT)，BCA法對可溶表達的融合蛋白進行定量檢測。透析后融合蛋白樣品加入酶切緩沖液后每1 mg目的蛋白加入2 U腸激酶，4 ℃酶切10 h，利用TrxA- His與CTGF- CT標簽的差異性特點再次利用鎳柱純化并分離獲得目的蛋白(CTGF- CT)，BCA法進行定量，收集目的蛋白冷凍干燥后保存。上述原核表達及純化過程中得到的樣品均進行SDS- PAGE分析。

2.3 重組蛋白CTGF- CT的分析

CTGF- CT目的蛋白的Western blotting檢測：根據目的蛋白分子量，采用10%分離膠和5%濃縮膠進行SDS- PAGE凝膠電泳，冰浴下恒流200 mA，電轉移1 h；封閉后加入抗CTGF單克隆抗體(1∶1 500)，置振蕩器孵育，4 ℃過夜后PBST漂洗濾膜4次；將PVDF膜置于羊抗鼠HRP-IgG抗體(1∶1 500)溶液中，室溫下搖蕩標記1.5h后PBST漂洗濾膜5次；ECL顯色觀察結果。

3 實驗結果

3.1 pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重組質粒的鑒定

利用NcoI和XhoI限制性內切酶對引物F、引物R所合成基因產物和pET32a載體同時進行雙酶切，連接回收后片段構建成重組表達載體pET32a- TrxA- His- CTGF- CT。將陽性轉化克隆中所提取質粒利用NcoI和XhoI雙酶切，結果在圖2中可見大小分別為5 kb和400 bp左右的條帶，其中400 bp左右的條帶為特征性片段。同時，DNA測序證實CTGF- CT閱讀框正確無誤，表明pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重組質粒表達載體構建成功。

M.DNA分子量標準; 1. pET32a- TrxA- His- CTGF- CT質粒; 2. pET32a- TrxA- His- CTGF- CT質粒雙酶切

圖2 pET32a- TrxA- His- CTGF- CT表達載體的酶切鑒定

3.2 CTGF- CT蛋白的表達及純化

將IPTG(0.5 mmol·L-1)誘導表達1、2、4、6、8 h后的菌體裂解后超聲破碎，離心后所獲上清和沉淀分別進行SDS- PAGE分析，結果顯示在28 kD左右有目標重組蛋白表達且與融合蛋白理論分子量相符，重組融合蛋白的表達大部分以可溶性形式存在于上清(圖3)。利用BCA法測得融合蛋白在3次洗脫液中的濃度分別為2.63、1.36和1.13 mg·ml-1，3次洗脫液體積分別為500、400和300 μl，計算得出1 L菌液共收獲6.20 mg可溶融合蛋白(TrxA- His- CTGF- CT)。

重組表達載體pET32a- TrxA- His- CTGF- CT的構建是在pET32a(+)載體上利用NcoI和XhoI酶切位點插入目的蛋白CTGF- CT基因，使其以TrxA- His- CTGF- CT融合蛋白的形式表達。利用His- Tag與Ni- IDA親和層析介質的結合進行融合蛋白的純化簡便有效，融合蛋白進行Western blotting分析(圖4 Lane 2)。經腸激酶酶切后融合蛋白被酶切為TrxA- His和CTGF- CT，酶切反應液利用固定金屬親和層析(IMAC)進一步純化，從凝膠層析流出液中收集目的CTGF- CT蛋白(圖5 Lane 2)，BCA法蛋白定量檢測計算得出1 L菌液共收獲2.31 mg目的蛋白CTGF- CT。

M.蛋白標準品; 1.未加誘導劑菌體對照; 2～6.誘導1、2、4、6和8 h菌體超聲后上清

圖3 重組質粒在大腸桿菌BL21(DE3)中表達的SDS- PAGE分析

M.蛋白標準品; 1.純化的CTGF- CT; 2.純化的融合蛋白

圖4 融合蛋白及目的蛋白純化后Western blotting分析

3.3 重組蛋白CTGF- CT的分析

利用直接ELISA檢測純化所得CTGF C端CT區即CTGF- CT的活性(圖6)，Western blotting鑒定純化所獲蛋白(圖4 Lane 1)。

4 討 論

CTGF(CCN2)是由349個氨基酸殘基組成的分泌性多肽，分子量為36～38 kDa。CTGF可以促進細胞增殖[7- 8]及細胞外基質的形成[2]，在介導細胞黏附[1]、遷移[9]、炎癥[10- 11]及促進血管形成中發揮廣泛的作用[1- 2]。CTGF的C端即CT區功能結構域在促進細胞黏附[3,12]、激活促炎癥因子[6]、調節轉錄[4]、激活信號通路[5]、直接介導CTGF與整合素受體之間的結合[13]等方面發揮重要作用。因此，本研究關注CTGF的C端結構域即CT區(CTGF- CT)的表達純化，制備生產足量優質的CTGF- CT重組蛋白，以利于后續相關特異性抗體研究和功能研究。

M.蛋白標準品; 1、6.未加誘導劑對照; 2.腸激酶切割液上鎳柱后流出液;3.腸激酶切割液; 4.鎳柱純化的融合蛋白TrxA- His- CTGF- CT; 5.誘導后菌體蛋白; 7.腸激酶切割液上鎳柱后洗脫液

圖5 融合蛋白及目的蛋白純化的SDS- PAGE分析

圖6 ELISA檢測表達蛋白的活性

E.coli系統遺傳圖譜明確、操作簡便易行、生產成本較低，且對許多蛋白質有很強的耐受力，是許多重組蛋白的首選表達系統。在E.coli表達系統中，融合蛋白表達系統可提高目的蛋白的產量、減少蛋白質的錯誤折疊和包涵體的形成、方便后續分離純化。本實驗選用IPTG誘導啟動子表達載體(pET32a)，構建pET32a- TrxA- His- CTGF- CT原核表達載體，CTGF- CT目的蛋白N端融合硫氧還蛋白(TrxA)并引入組氨酸標簽，方便進行重組蛋白CTGF- CT的體外表達及純化，以期獲得可溶表達的重組蛋白。分子伴侶TrxA的引入可以幫助外源蛋白成功表達、降低宿主細胞對外源蛋白的降解從而可以大大提高蛋白表達產量、可溶性[14]及穩定性[15]；利用組氨酸標簽與Ni2+相互作用進行親和層析純化，簡便有效；pET32a帶有pBR322的大腸菌素E1(colE1)復制區，賦予宿主菌氨芐青霉素抗性，有利于陽性克隆子的篩選；為方便后續純化，pET32a載體中XhoI酶切位點后的His- Tag已去除，僅保留Trx- Tag后的His- Tag。本研究所構建pET32a- TrxA- His- CTGF- CT重組質粒轉化E.coliBL21(DE3)IPTG誘導表達并純化得到純度大于90%的可溶性TrxA- His- CTGF- CT融合蛋白，在大腸桿菌成功表達。SDS- PAGE結果顯示目標蛋白表達位于28 kD處，這與融合蛋白TrxA- His- CTGF- CT的理論分子量一致，且大部分為可溶蛋白表達形式。

本實驗中表達的融合蛋白TrxA- His- CTGF- CT的N- 末端連接有His標簽，利用鎳親和層析柱純化融合蛋白，結果顯示融合蛋白純度達90%以上；TrxA- His- CTGF- CT融合蛋白中His- Tag與CTGF- CT間為腸激酶酶切位點，利用腸激酶的識別酶切對融合蛋白進行切割，利用鎳親和層析對酶切反應液再次進行分離純化即可獲得目的蛋白CTGF- CT。從圖4 SDS- PAGE結果中Lane 4、Lane 5和Lane 7可以看出融合蛋白被腸激酶識別切割；酶切下的CTGF- CT不含His- Tag，因此在融合蛋白第2次鎳親和層析純化過程中，可在流穿液中收集即可獲得目的蛋白CTGF- CT，SDS- PAGE分析顯示其純度大于95%。利用上述純化方法可在1 L菌液中獲得毫克級別的重組蛋白。ELISA檢測結果顯示，融合蛋白與Anti- CTGF具有良好的結合活性；去除TrxA、His等氨基酸后CTGF- CT與Anti- CTGF結合未受影，仍具有良好的結合活性。同時Western blotting分析驗證了融合蛋白TrxA- His- CTGF- CT和目的蛋白CTGF- CT。

因此，我們純化得到了理想的CTGF- CT蛋白，可用于后續相關研究工作，同時為進一步研究CTGF- CT的功能奠定了基礎。

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(本文編輯：周蘭波)

Prokaryotic expression and purification of connective tissue growth factor(CT domain) inE.coli

XUE Xiu- lei1,FAN Xiao- bo1,WU Guo- qiu2

(1.MedicalSchoolofSoutheatUniversity,Nanjing210009,China; 2.ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China)

Objective: To construct the recombinant pET32a- TrxA- His- CTGF- CT plasmid and to express and purify CT domain of connective tissue growth factor(CTGF) in order to prepare CTGF- CT polyclonal antibody. Methods: The nucleotide sequence encoding CTGF- CT was chemically synthesized and inserted into the pET- 32a(+) vector. The constructed pET32a- TrxA- His- CTGF- CT plasmid was transformed intoE.colistrain BL21(DE3). And the TrxA- CTGF- CT fusion protein was induced expression by IPTG; Then CTGF- CT was purified by enterokinase cleavage and Ni- NTA purification and was identified by SDS- PAGE and Western blotting. Results: The authenticity of the recombinant pET32a- TrxA- CTGF- CT- His plasmid was verified by DNA sequencing and it was identified containning a 400 bp fragment byNcoI andXhoI double digestion. The molecular weight of TrxA- CTGF- CT was about 28 kD after IPTG induced expression. After enterokinase cleavage and Ni- NTA purification, the CTGF- CT was obtained as expected molecular weight of 14 kD. Western blotting proved that the protein was CTGF- CT. The purity of the recombinant CTGF- CT was about 95%. Conclusion: The construction of pET32a- TrxA- His- CTGF- CT and the expression and purification of CTGF- CT are successfully achieved. That will lay the foundations for preparation of CTGF- CT antibody and the further study on the function of CTGF- CT.

connective tissue growth factor; prokaryotic expression; protein purification

2016- 09- 08

2016- 12- 06

薛秀蕾(1984-)，女，山東聊城人，醫學博士。E- mail: xiulei_xue@163.com

吳國球 E- mail: nationball@163.com

薛秀蕾,范小波,吳國球. 結締組織生長因子CT結構域的原核表達及分離純化[J].東南大學學報:醫學版,2017,36(2):230- 234.

R- 33; R393

A

1671- 6264(2017)02- 0230- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.020