馬鈴薯渣發酵產活性蛋白飼料培養基優化

羅倉學, 宋雅蕓, 邵明亮

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

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馬鈴薯渣發酵產活性蛋白飼料培養基優化

羅倉學, 宋雅蕓, 邵明亮

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

選用黑曲霉、啤酒酵母對馬鈴薯渣進行固態發酵，研究原輔料比、料水比、尿素和硫酸銨對發酵產品中真蛋白含量、酸性蛋白酶活和纖維素酶活的影響，并對發酵培養基進行優化.結果表明，優化后馬鈴薯渣培養基組分為:原輔料比85∶15、料水比1∶2、尿素添加量2.0%、硫酸銨添加量1.0%，在此培養基中接入10%(v/w)的黑曲霉、啤酒酵母(1∶1)混合種子液，在28 ℃下培養120 h后發酵產品中真蛋白含量、酸性蛋白酶活、纖維素酶活分別較未優化前提高了287.79%、229.45%、1 755.34%.

固態發酵； 馬鈴薯渣； 活性蛋白； 優化

0 引言

馬鈴薯淀粉加工過程中產生的下腳料—馬鈴薯渣，具有排放量大、含水率高、營養豐富、自帶菌種繁多等特點，若不及時有效地處理，微生物極易滋生導致腐敗酸臭，既造成資源浪費，又污染環境[1-4].故資源化利用馬鈴薯渣已成為馬鈴薯淀粉加工業亟待解決的問題.目前，馬鈴薯渣已被研究人員用來生產燃料酒精、提取果膠、制備酶制劑等[1,5-7].其中利用微生物發酵技術生產蛋白飼料是實現馬鈴薯渣資源有效利用的重要途徑之一.

近年來，利用馬鈴薯渣固態發酵生產菌體蛋白飼料已有報道，多集中在提高蛋白質含量上[8-10]，而對活性蛋白飼料的研究較少，僅程方[11]對滅菌的馬鈴薯渣發酵產活性蛋白飼料進行了研究.但滅菌處理會增加能耗，不利于工業化生產.本試驗以馬鈴薯渣為原料，麩皮為輔料，采用不滅菌處理，探究原輔料比、料水比、尿素和硫酸銨對發酵產品真蛋白含量、酸性蛋白酶活和纖維素酶活的影響，并對其進行優化，以確定馬鈴薯渣發酵產蛋白飼料的最優培養基.為資源化利用馬鈴薯渣制備活性蛋白飼料探究可行途徑.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

(1)主要材料：馬鈴薯干渣，由陜西省定邊縣源澤農業科技開發有限公司提供；麩皮，市售；黑曲霉C27、啤酒酵母B186，均由陜西省微生物研究所提供；PDA培養基、麥芽汁瓊脂培養基、麥芽汁液體培養基，實驗室自制；福林酚試劑，購自美國Sigma公司；干酪素、L-酪氨酸，均購自上海源葉生物科技有限公司；尿素、硫酸銨、硼酸、硫酸銅、3,5-二硝基水楊酸等，均為國產分析純.

(2)主要試劑：MA35快速水分測定儀，上海賽多利斯貿易有限公司；DK-98馬弗爐，天津市泰斯特儀器有限公司；K9840半自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；XSY-1散落熒光顯微鏡 ，重慶光學儀器廠；ZWY-100H恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；GH-420ASB隔水式培養箱，北京科偉永興儀器有限公司；755B紫外可見光光度計，上海菁華科技儀器有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 馬鈴薯渣發酵生產蛋白飼料的工藝路線

工藝路線如下所示：

斜面菌種→活化→擴培→發酵種子液

↓

馬鈴薯渣→配料→拌勻→接種→固態發酵→烘干→粉碎→測定分析

1.2.2 發酵種子液的制備

將經過傳代活化后的斜面菌種挑取一環于麥芽汁液體培養基中，在28 ℃、150 r/min搖床中動態培養(黑曲霉24 h，酵母菌12 h)，后取1 mL種子液用無菌生理鹽水做10倍梯度稀釋，經血球計數板計數，測得啤酒酵母孢子數為106個/mL，黑曲霉為108CFU/mL.

1.2.3 原輔料比對發酵產物的影響

固定尿素添加量為2%、硫酸銨添加量為1.5%、料水質量比為1∶1.5，分別設定薯渣與麩皮質量比為100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25、70∶30攪拌均勻后接入10%(v/w)的發酵種子液(黑曲霉∶啤酒酵母=1∶1)，在28 ℃恒溫箱、自然pH 值條件下靜置培養120 h，45 ℃下烘干，粉碎后測定發酵產物中的真蛋白含量、酸性蛋白酶活及纖維素酶活.

1.2.4 料水比對發酵產物的影響

固定原輔料質量比為85∶15、尿素添加量為2%、硫酸銨添加量為1.5%，分別設定料水質量比為1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5，攪拌均勻后接入10%(v/w)的發酵種子液(黑曲霉∶啤酒酵母=1∶1)，在28 ℃恒溫箱、自然pH 值條件下靜置培養120 h，45 ℃下烘干，粉碎后測定發酵產物中的真蛋白含量、酸性蛋白酶活及纖維素酶活.

1.2.5 尿素添加量對發酵產物的影響

固定原輔料質量比為85∶15、硫酸銨添加量為1.5%、料水質量比為1∶1.5，分別設定尿素添加量為0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，攪拌均勻后接入10%(v/w)的發酵種子液(黑曲霉∶啤酒酵母=1∶1)，在28 ℃恒溫箱、自然pH 值條件下靜置培養120 h，45 ℃下烘干，粉碎后測定發酵產物中的真蛋白含量、酸性蛋白酶活及纖維素酶活.

1.2.6 硫酸銨添加量對發酵產物的影響

固定原輔料質量比為85∶15、尿素添加量為1.5%、料水質量比為1∶1.5，分別設定硫酸銨添加量為0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，攪拌均勻后接入10%(v/w)的發酵種子液(黑曲霉∶啤酒酵母=1∶1)，在28 ℃恒溫箱、自然pH 值條件下靜置培養120 h，45 ℃下烘干，粉碎后測定發酵產物中的真蛋白含量、酸性蛋白酶活及纖維素酶活.

1.2.7 正交試驗優化固態發酵培養基

根據單因素實驗結果，設計四因素三水平L9(34)試驗對馬鈴薯渣發酵生產活性蛋白飼料的固態發酵培養基進行優化，如表1所示.

表1 正交試驗因素水平表(L9(34))

水平因素原輔料比料水比尿素添加量/%硫酸銨添加量/%190∶101∶11.00.5285∶151∶1.51.51.0380∶201∶22.01.5

1.3 測定方法

水分：水分測定儀測定；真蛋白：硫酸銅沉淀法[12]和凱氏定氮法(GB5009.5-2010)；淀粉：酶水解法(GB/T 5009.9-2008)；粗纖維：過濾法(GB/T 6434-2006)；果膠：氯化鈣沉淀法(GB/T 10742-2008)；灰分：(GB5009.4-2010)；還原糖：DNS比色法[13]；酸性蛋白酶活：福林法(GB/T 28715-2012)；纖維素酶活：DNS比色法(NY/T 912-2004).

1.4 數據分析

每個樣品平行做三次實驗.采用Excel和Origin8.0進行數據計算和繪圖.測定結果以平均值±標準差表示.采用SPSS17.0對數據進行顯著性分析，其中多重比較采用LSD法，以p<0.05為差異顯著.

2 結果與討論

2.1 原輔料比對發酵產物的影響

大量的研究發現，馬鈴薯渣單一發酵產活性蛋白飼料品質較差，且原料利用率不高[14].適當地添加麩皮可以提高基質透氣性，還能提供一定的營養物質[15]，故薯渣與麩皮配比對菌體的新陳代謝有重要的影響.由圖1可知，隨著麩皮比例的增加，發酵產物中真蛋白含量、纖維素酶活和酸性蛋白酶活均呈現先增加后減少的趨勢，具體表現為：發酵產物中真蛋白含量隨麩皮比例的增加明顯增加，隨后有緩慢回落的趨勢，薯渣與麩皮比例為85∶15和80∶20時真蛋白含量較高，且二者差異不顯著(p>0.05)；纖維素酶活和酸性蛋白酶活均在原輔料比為85∶15時最高，繼續增加麩皮比例，酶活都逐漸減小.分析原因可能是由于適量的麩皮能夠提高培養基體系內的氣體交換速率，從而促進蛋白的累積以及酸性蛋白酶和纖維素酶的產生；但當麩皮比例過大時，發酵基質膨松度高，水分易散失，菌體生長受到阻礙[8]，造成發酵產品中蛋白含量和酶量降低.因此原輔料比85∶15左右為宜.

圖1 不同原輔料比對發酵產物的影響

2.2 料水比對發酵產物的影響

水分是維持微生物生長及新陳代謝的重要影響因素，機體內一切生理生化反應與水分密切相關[16].由圖2可知，發酵產物中真蛋白含量、纖維素酶活以及酸性蛋白酶活隨水分含量的增加整體呈現先增加后減小的趨勢，造成此現象的原因可能是：培養基含水量較小時，自由水缺乏導致營養物質不能被菌體正常吸收、代謝產物排出受阻，從而降低原料利用率，造成蛋白含量降低、酶分泌量減少；培養基含水量太大時，培養基周圍容易形成水膜導致透氣性下降，微生物可能被迫進行無氧呼吸產酸產氣，最終造成菌體停止生長甚至死亡，所以真蛋白含量幾乎未見增加，纖維素酶活和酸性蛋白酶活也顯著下降.其中纖維素酶活和酸性蛋白酶活在料水比為1∶1.5時酶活分別達到最高；真蛋白含量在料水比為1∶1、1∶1.5、1∶2時達到最高，且三者差異不顯著(p>0.05).綜合比較，選擇料水比為1∶1.5進行后續實驗.

圖2 不同料水比對發酵產物的影響

2.3 尿素添加量對發酵產物的影響

由圖3可知，隨尿素含量的增加，發酵產物中真蛋白、纖維素酶活和酸性蛋白酶活變化稍有差異，表現為真蛋白含量隨尿素含量的增加呈現先增加后減少，而纖維素酶活和酸性蛋白酶活呈現先增加再減小后緩慢回升.分析原因可能是適量的氮源供給有利于微生物在細胞內合成氨基酸和堿基，進而合成蛋白質[16]；繼續添加尿素，蛋白合成量反而降低，可能是發酵后期可利用碳源逐漸減少，造成碳氮比不合理，微生物生長受到抑制，也可能是未被利用的尿素水解釋放出NH4+，使得發酵環境pH改變，菌體生長受到影響，從而蛋白含量和酶活降低；當尿素添加量大于2.5%時，纖維素酶活和酸性蛋白酶活緩慢上升的原因可能是受到雜菌的影響.綜合考慮對各指標的影響，選擇尿素添加量1.5%左右為宜.

圖3 不同尿素添加量對發酵產物的影響

2.4 硫酸銨添加量對發酵產物的影響

無機態氮是絕大多數微生物都能夠利用的營養物質，常用的有銨鹽、硝酸鹽等[16].研究發現硫酸銨比硝酸鹽更有利于微生物生長代謝[17].由圖4可知，隨硫酸銨含量的增加，發酵產物中真蛋白、纖維素酶活和酸性蛋白酶活整體上都表現為先增加后減少的趨勢，分析原因可能是硫酸銨屬于強酸弱堿鹽，添加量過高導致部分NH4+水解促進SO42-和H+的累積，使得微生物生長環境偏酸性，改變細胞膜的通透性，進而影響營養物質和代謝產物進出細胞.由圖4可知真蛋白累積量在硫酸銨添加量為0.5%和1.0%時較高，纖維素酶活和酸性蛋白酶活分別在硫酸銨添加量為1%和1.5%時達到最大值.綜合比較，硫酸銨添加量為1.0%左右較合適.

圖4 不同硫酸銨添加量對發酵產物的影響

2.5 正交優化結果及分析

由表2極差分析得出，四個因素對真蛋白含量影響的主次順序為B>D>A>C，即料水比對發酵產物真蛋白含量的影響最為顯著，其次為硫酸銨添加量和原輔料比，影響最小的是尿素添加量，最適宜合成真蛋白的發酵培養基組合為A1B3C3D3；四個因素影響纖維素酶活的主次順序為A>D>B>C，即原輔料比對纖維素酶的產生最為顯著，其次為硫酸銨添加量和料水比，尿素添加量對纖維素酶的產生影響最小，產纖維素酶的最優發酵培養基組合為A3B3C1D2；四個因素對酸性蛋白酶活的影響主次順序為B>D>A>C，即料水比影響最顯著，其次為硫酸銨添加量和原輔料比，尿素添加量影響最小，適宜產酸性蛋白酶的最優發酵培養基組合為A2B1C3D2.綜上，三種最優培養基組合中共同的部分為B3C3D2，因此綜合考慮選擇A2B3C3D2作為馬鈴薯渣發酵產活性蛋白飼料的最佳發酵培養基組合.

表2 固態發酵培養基正交試驗結果及極差分析表

由表3方差分析可知，四個因素對真蛋白含量、纖維素酶活以及酸性蛋白酶活的影響差異均顯著(p<0.05).經驗證實驗，結果如下：發酵的產品中真蛋白含量達18.11%，纖維素酶活達83.68 U/g，酸性蛋白酶活達1 126.56 U/g.

表3 正交試驗方差分析表

2.6 優化后發酵產物成分分析

由表4可得，采用不滅菌處理，優化后的馬鈴薯培養基發酵完成后發酵產物中真蛋白含量較原馬鈴薯渣提高了287.79%，纖維素酶活和酸性蛋白酶活分別提高了229.45%、1 755.34%，粗纖維、淀粉以及果膠含量分別降低了44.88%、23.87%、23.71%，還原糖和灰分含量均有所提高.發酵產品呈棕褐色，具有淡淡的醇香味，并留存一定的薯香味.與滅菌處理的馬鈴薯渣相比[11]，本試驗優化后發酵產物中真蛋白含量、酸性蛋白酶活、纖維素酶活分別占滅菌優化的47.65%、70.72%、74.47%，以上數據顯示：不滅菌發酵的馬鈴薯渣酶活性與滅菌發酵的相差不大，真蛋白含量相差偏大.造成真蛋白含量差異的原因是程方所測指標為粗蛋白，其值大于真蛋白值，因此馬鈴薯渣不滅菌處理發酵制備活性蛋白飼料具有一定的可行性.

表4 馬鈴薯渣發酵前后主要成分對比表

3 結論

本實驗以混菌固態發酵馬鈴薯渣生產活性蛋白飼料，采用不滅菌處理，對影響發酵菌種的各營養成分進行單因素和正交試驗，得出最佳的馬鈴薯渣發酵培養基為：原輔料比85∶15、料水比1∶2、尿素添加量2.0%、硫酸銨添加量1.0%，發酵完成后馬鈴薯渣中真蛋白含量、纖維素酶活和酸性蛋白酶活分別達到18.11%、83.68 U/g和1 126.56 U/g，粗纖維、淀粉、果膠等抗營養因子很大程度被降解，發酵所得的蛋白飼料營養品質好，更利于動物消化吸收.且操作方便，省時易行，能耗少，成本低，為資源化利用馬鈴薯渣、工業化生產蛋白飼料提供一定的參考.

[1] Mintian G,Shinchi Y,Hiroyuki I,et al.Production of ethanol from potato pulp: Investigation of the role of the enzyme from acremonium cellulolyticus in conversion of potato pulp into ethanol[J].Process Biochemistry,2012,47(12):2 110-2 115.

[2] 曾凡逵,周添紅,劉 剛.馬鈴薯淀粉加工副產物資源化利用研究進展[J].農業工程技術,2013(11)：33-37.

[3] Lei Heng,Wang Huili,Ning Tingting,et al.Protein enrichment of potato starch residue by solid state fermentation with mixed strains[J].Journal of Animal and Veterinary Advances,2012,11(15):2 700-2 705.

[4] 吳海燕.馬鈴薯渣資源循環利用的工藝技術研究[D].廣州：華南理工大學,2012.

[5] Zhang Zhe,Luo Xinsheng,Liu Yani,et al.A low cost and highly efficient adsorbent (activated carbon) prepared from waste potato residue[J].Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers,2015,49:206-211.

[6] Waglay A,Karboune S,Khodadi M.Investigation and optimization of a novel enzymatic approach for the isolation of proteins from potato pulp[J].LWT-Food Science and Technology,2016,65:197-205.

[7] Pushpa S M,Kenichi K.Acid protease production by aspergillus oryzae on potato pulp powder with emphasis on glycine releasing activity:A benefit to the food industry[J].Food and Bioproducts Processing,2015,96:180-188.

[8] 周 芳.馬鈴薯渣發酵蛋白飼料的研究[D].烏魯木齊：新疆大學,2015.

[9] 贠建民,劉隴生,安志剛,等.馬鈴薯淀粉渣生料多菌種固態發酵生產蛋白飼料工藝[J].農業工程學報,2010,26(2)：399-404.

[10] 張微微,張永根,劉 震.響應面法優化馬鈴薯渣固態發酵生產奶牛飼料工藝條件研究[J].東北農業大學學報,2013,44(12)：113-118.

[11] 程 方.固態發酵馬鈴薯渣生產活性蛋白飼料的研究[D].楊凌：西北農林科技大學,2015.

[12] 李巨秀.混菌種發酵果渣生產蛋白飼料的研究[D].楊凌：西北農林科技大學,2002.

[13] 陳 娟,王治業,魏甲乾,等.多菌種分步固態發酵果渣生產菌體蛋白飼料的工藝優化[J].中國釀造,2014,33(3)：40-44.

[14] Xu Y G,Yu H,Zhang L,et al.Probiotic properties of genetically engineeredLactobacillusplantarum producing porcine lactoferrin used as feed additive for piglets[J].Process Biochemistry,2016,51(6)：719-724.

[15] 蔡維此，姜海龍，王 鵬，等，酵母菌固態發酵馬鈴薯渣的研究[J].吉林畜牧獸醫,2014(10)：10-14.

[16] 樊明濤,趙春燕,雷曉凌.食品微生物學[M].鄭州：鄭州大學出版社,2011.

[17] 莊童琳,李 虎,郭鳳霞,等.黑曲霉固態混菌發酵蘋果渣生產多酶生物飼料[J].食品工業科技,2010,31(12)：171-175.

【責任編輯：陳 佳】

Optimization of culture medium for producing active protein feed from potato residue by solid-state fermentation

LUO Cang-xue, SONG Ya-yun, SHAO Ming-liang

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Potato residue was fermented byAspergillusnigerandBrewer′syeastto produce active protein feed.The aim of this paper was to study the effect of raw material-accessories ratio,liquid-solid ratio,urea concentration and ammonium sulfate concentration on the true protein content,acid protease activity and cellulose activity of fermentation products by solid-state fermentation and optimize the optimal medium components of potato residue.The results showed that the optimal medium components were:raw material-accessories ratio 85∶15，liquid-solid ratio 1∶2，urea concentration 2.0%,ammonium sulfate concentration 1.0%.In the medium,10% (v/w) ofAspergillusnigerandBrewer′syeast(1∶1) mixed seed liquid were incubated at 28 ℃ for 120 h.The true protein content,acid protease activity and cellulase activity of the fermentation products compared with raw potato residue were increased by 287.79%,229.45% and 1755.34%,respectively.

solid-state fermentation; potato residue; active protein feed; optimization

2016-11-24

榆林市輕工綠色產業技術研發及示范基地建設項目(2012CXY1-09)

羅倉學(1959-)，男，陜西扶風人,教授，研究方向:食品加工及資源綜合開發利用

2096-398X(2017)03-0127-05

TS239；S816.4

A