微囊細胞Nisin發酵條件的研究

賀小賢， 魏潔茹， 宇文亞煥，2， 鄭茂奎 ， 胡 瑾

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021； 2.陜西國際商貿學院 醫藥學院， 陜西 咸陽 712046)

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微囊細胞Nisin發酵條件的研究

賀小賢1， 魏潔茹1， 宇文亞煥1，2， 鄭茂奎1， 胡 瑾1

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021； 2.陜西國際商貿學院 醫藥學院， 陜西 咸陽 712046)

為了提高乳鏈菌肽(Nisin)的生產效率，采用嗜熱乳鏈球菌6032 ACA微囊細胞發酵生產乳鏈菌肽(Nisin).比較微囊化細胞與游離細胞的發酵效果，并通過電鏡對不同時期的微囊壁結構進行觀察，確定微囊的穩定性.在單次單因素實驗的基礎上，根據Box-Behnken中心組和設計原理，采用響應面法優化發酵條件.實驗結果表明微囊細胞發酵的效價高于游離細胞，在一定時間內，微囊細胞發酵穩定性好，隨著時間的延長，微囊破裂，效價降低.實驗確定的最適條件為：pH 6.1，培養溫度28.7 ℃，發酵時間20 h，在此條件下得到Nisin的效價為5 460.00 IU/mL.經實驗驗證實驗值與理論預測值擬合良好，證明通過響應面分析法對嗜熱乳鏈球菌6032 ACA液芯微囊發酵生產Nisin發酵條件的優化是有效的.

嗜熱乳鏈球菌； ACA液芯微囊； Nisin； 發酵條件； 響應面分析

0 引言

乳鏈菌肽，又被稱為乳酸鏈球菌素或乳鏈球菌肽，英文名為Nisin，是乳酸球菌屬微生物代謝過程中合成和分泌的一類具有抑菌作用的小分子肽，也是美國食品和藥物管理局(FDA)以及世界衛生組織(WTO)允許商業化生產的食品添加劑[1].它能夠有效抑制大部分革蘭氏陽性細菌以及芽孢桿菌的繁殖，特別是對金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌的抑制作用明顯[2-4].

但游離的乳酸菌在發酵的過程中存在無法重復利用和Nisin產率低等問題，為了解決這一問題，有學者提出利用細胞微膠囊技術[5,6]來發酵生產Nisin.Kordikanlioglu B[7]和Simsek O[8]通過構建表面含幾丁結構的乳酸菌微囊，實現了連續發酵生產Nisin.有研究表明制備ACA微囊有利于菌體的生長和代謝.而在Nisin發酵的過程中其Nisin效價不僅受到液芯微囊的影響，也受到發酵pH[9]、鹽離子濃度、接種量、培養溫度[10]及發酵時間等的影響.本實驗采用嗜熱鏈球菌6032 ACA液芯微囊發酵生產乳鏈菌肽，優化生產條件，提高乳鏈菌肽的效價和產率，為工業化應用打下良好的基礎.

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

(1)主要材料：嗜熱乳鏈球菌6032，金黃色葡萄球菌均是保藏于本實驗室.殼聚糖(DD≧80%～95%，80目，Japan)；海藻酸鈉，無水氯化鈣，檸檬酸鈉，氯化鈉，磷酸氫二鈉，硫酸鎂，蔗糖，葡萄糖，磷酸二氫鉀均為(天津市天力化學試劑有限公司)；蛋白胨，瓊脂粉，酵母浸粉均為(北京奧博星生物技術有限公司)；檸檬酸氫二胺(天津登豐化學試劑有限公司)，硫酸錳(洛陽市化學試劑廠)，以上試劑均為分析純.玉米漿(陜西寶雞阜豐有限公司)工業級，吐溫-80(中國成都金山化學試劑廠)化學純，冰乙酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)色譜純.

(2)主要儀器：Nisin標準品，美國Sigma公司.場發射掃描電鏡，S4800，日本理學.

1.2 培養基

1.2.1 種子培養基

種子培養基成分：蔗糖1 g，酵母膏1 g，蛋白胨1 g，磷酸二氫鉀0.2 g，氯化鈉0.2 g，硫酸鎂0.02 g，吐溫-80 0.05 mL，蒸餾水100 mL，pH=7.2.將其在121 ℃下滅菌30 min.

1.2.2 發酵培養基

發酵培養基的成分：蔗糖1 g，酵母膏1 g，蛋白胨1 g，磷酸二氫鉀0.2 g，硫酸錳0.058 g，硫酸鎂0.025 g，檸檬酸氫二銨0.2 g，玉米漿20%，蒸餾水100 mL.將其在121 ℃下滅菌30 min.

1.2.3 效價檢測培養基

效價檢測培養基(g/L)：蛋白胨8.0 g，葡萄糖5.0 g，酵母浸粉2.5 g，磷酸氫二鈉2.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂粉10.0 g，蒸餾水1 000 mL ，pH7.2～7.4.將所配制的培養基于121 ℃進行滅菌30 min.

1.3 實驗方法

1.3.1 種子液的培養

將活化3次后的菌種接入到經過高壓滅菌的種子液中，在35 ℃下培養18 h，菌體濃度計數為6.7×109CFU/mL.

1.3.2 游離菌體進行發酵

采用分批發酵法：將種子液接入發酵培養基中，在一定的溫度和pH條件下靜止培養一段時間.

1.3.3 嗜熱乳鏈球菌6032ACA液芯微囊制備及發酵培養

用擠壓法制得ACA嗜熱乳鏈球菌6032液芯微囊[11].將準備好的微囊以5%的接種量接入發酵培養基中，并在一定pH下以一定的溫度培養一段時間.

1.3.4 響應面實驗設計

在單次單因素實驗的基礎上，使用Design-Expert軟件的Box-Behnken模型響應面設計，以發酵液中的初始pH，培養溫度，發酵時間為自變量，以Nisin的效價為響應值，擬合自變量和響應值之間的關系.實驗設計如表1所示.

表1 實驗設計及因素水平

1.3.5 測定方法

Nisin效價的測定：運用瓊脂擴散法[12]測定Nisin的效價.

2 結果與討論

2.1 微囊發酵方法以及對比實驗

通過對微囊細胞發酵及游離細胞發酵生產Nisin進行對比，得出其各自發酵生產Nisin的特性.其實驗結果如圖1所示.

圖1 微囊化細胞與游離細胞發酵Nisin的比較

從圖1可以看出，游離細胞發酵進行10 h時開始有大量Nisin的產生，在發酵15 h時Nisin達到最高水平，隨著發酵時間的增加，Nisin的效價開始下降.微囊化細胞在10 h時也有Nisin積累，但是低于游離細胞發酵，隨著發酵的進行，微囊化細胞發酵在20 h時達到最高水平且高于游離細胞水平.可以看出單批次發酵時微囊化發酵方式的周期要大于游離細胞，這可能是因為游離細胞在發酵液中可以直接利用營養物質代謝生產Nisin，而微囊化發酵方式中底物和產物的傳質需要消耗一定的時間.利用微囊化細胞生產Nisin，能夠提高Nisin的效價，因為微囊化細胞發酵時，微膠囊提供一個相對穩定的環境，減少了外界環境的影響，菌體的活性穩定，同時囊內的代謝產物達到一定濃度后可以擴散到囊外，解除了產物的反饋抑制作用，使得菌體能夠連續的產生Nisin，有利于Nisin效價的提高.

2.2 微膠囊顆粒發酵批次的測定

使用微囊化細胞發酵生產Nisin，每隔20 h更換新鮮培養基，反復發酵，分別測定Nisin的效價，考察微膠囊顆粒的使用批次，其實驗結果如圖2所示.

圖2 不同發酵批次Nisin的效價

由圖2可知發酵初始時Nisin的效價比較低，因為在發酵初期由于微膠囊顆粒致密，營養物質的傳遞和Nisin的傳質需要消耗一定的時間，發酵初始階段Nisin的效價較低，隨著發酵批次的增加微囊化細胞能夠連續穩定代謝產生Nisin.當發酵進入第12批次時，Nisin的效價開始下降.因為隨著發酵的進行，代謝副產物的影響，微囊化顆粒變得膨脹，部分微膠囊發生破裂.當發酵進入17批次時，微膠囊顆粒損壞嚴重，Nisin的效價水平較低.

為了觀察微膠囊在發酵過程中的破損情況，從而確定微囊的穩定性，對不同發酵批次的微膠囊壁進行電鏡掃描，如圖3所示.

(a)微膠囊顆粒壁 (b)發酵12批次微膠囊壁

(c)發酵17批次微膠囊壁圖3 不同發酵時間ACA微膠囊壁的結構掃描電鏡(×500)

圖3(a)表示制備好的微膠囊壁是由許多結構纏繞在一起形成的致密狀結構，其機械性能較好.當微表面膠囊使用12批次后，Nisin的效價開始下降，對微膠囊壁進行電鏡掃描，如圖3(b)所示.從圖3(b)可以看出,囊內部結構交聯性下降，囊壁有所破損；隨著發酵批次的增加，微膠囊壁結構的連接性變得更差，當發酵進行到17批次時，Nisin效價水平最低.對微膠壁進行結構電鏡觀察，結果如圖3(c)所示.由圖3(c)可知，微膠囊壁的結構已經破碎，微膠囊已經不適用于發酵生產，因此，制備的微膠囊可以發酵生產Nisin 12批次.

2.3 ACA微囊發酵生產Nisin影響因素研究

在單因素實驗的基礎上進行響應面分析，通過Box-Behnken模型.文獻[13-16]分析發酵初始pH、培養溫度、發酵時間對Nisin效價的影響.

響應值R(Nisin的效價)的實驗結果和方差分析如表2和表3所示.用軟件Design-expert對實驗結果進行二次回歸分析，得到二次多項式回歸模擬方程R(Nisin的效價)=5 447.67+22.00A+59.50B+6.5C+201.00AB+21.001AC+135.50BC-432.58A2-287.08B2-281.08C2.

表2 響應面實驗設計及結果

由表3可以看出，該回歸模型是顯著的(p=0.003 7<0.05)，失擬項(p=0.087>0.05)不顯著.而模擬的回歸系數(R2)為0.965 9，說明擬合度良好，實驗中的誤差小.在方差一次項中B的p<0.01，差異極其顯著，而A和C的p>0.05，差異不顯著.而二次項的影響中A2、B2、C2的p<0.01，所以其對Nisin效價影響極顯著；AB、BC的交互作用p<0.05，說明其對Nisin效價的影響是顯著的，AC的交互作用p>0.05，交互差異不顯著.

表3 響應面值R(Nisin效價)的方差分析

注：“*”表示差異顯著(p<0.05)；“**”表示差異極顯著(p<0.01).

(a)發酵pH和培養溫度對乳鏈菌肽效價影響的響應面圖

(b)發酵pH和培養溫度對乳鏈菌肽效價影響的等高線圖圖4 發酵液pH與培養溫度對乳鏈菌肽效價的響應面圖與等高線圖

經過Design-expert處理后得到響應面的曲面和等高線的圖如圖4、圖5、圖6所示.由圖4可以看出，發酵液pH與培養溫度對Nisin效價存在相互交叉影響，且影響顯著.響應面曲線口朝下說明在A和B交互作用下Nisin效價有最大值.圖5中，發酵pH和發酵時間無交互作用.由圖6可以看出，培養溫度與發酵時間有交互作用，不過交互作用影響的顯著性不強，而說明曲面口向下，B和C交互作用下Nisin效價有最大值.

(a)發酵pH和發酵時間對乳鏈菌肽效價影響的響應面圖

(b)發酵pH和發酵時間對乳鏈菌肽效價影響的等高線圖圖5 發酵液pH與發酵時間對乳鏈菌肽效價的響應面圖與等高線圖

驗證實驗：通過響應面軟件進行優化分析，得出嗜熱乳鏈球菌6032 ACA液芯微囊發酵生產Nisin的最佳條件是：pH6.11、培養溫度28.68 ℃、發酵時間20.19 h，Nisin效價為5 476.10 IU/mL.為檢驗實驗的可行性，利用最優的發酵條件進行發酵實驗，同時考慮到實際操作的便利，將最佳的發酵條件修正為pH6.1、培養溫度28.7 ℃、發酵時間20 h，實際測得的Nisin效價為5 460.00 IU/mL，與理論值相差較小.說明響應面分析所得的優化模型是可靠的.

(a)培養溫度和發酵時間對乳鏈菌肽效價影響的響應面圖

(b)培養溫度和發酵時間對乳鏈菌肽效價影響的等高線圖圖6 培養溫度與發酵時間對乳鏈菌肽效價的響應面圖與等高線圖

3 結論

(1)采用制備的微膠囊進行發酵生產，微囊化發酵與游離細胞發酵對比，微囊化發酵具有較長的發酵周期，但Nisin的效價要高于游離細胞發酵.微囊化細胞生產Nisin能夠反復使用12個批次，Nisin的效價穩定.

(2)在單因素實驗的基礎上，通過Box-Behnken中心組和試驗設計分析發酵初始pH、培養溫度、發酵時間對Nisin效價的影響，培養溫度對Nisin效價的影響最大，其次是發酵pH，最后是發酵時間.且培養溫度對響應值R(Nisin效價)的影響極顯著.再把響應面軟件分析結果進行優化分析，并進行可行性實驗.

(3)通過響應面優化，確定嗜熱乳鏈球菌6032 ACA液芯微囊發酵生產Nisin的最佳發酵條件為：發酵初始pH為6.1，培養溫度為28.7 ℃，發酵時間為20 h.在此條件下Nisin的效價為5 460.00 IU/mL.經驗證實驗結果表明該模型適用于嗜熱鏈球菌6032 ACA微囊發酵生產Nisin.

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【責任編輯：陳 佳】

Study on the fermentation conditions ofstreptococcusmicrocapsule cell for the production of Nisin

HE Xiao-xian1， WEI Jie-ru1， YU WEN Ya-huan1，2， ZHENG Mao-kui1， HU Jin1

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China； 2.School of Pharmacy, Shaanxi Institute of International Trade & Commerce, Xianyang 712046, China)

In order to enhance the production efficiency of Nisin,which was fermentation produced byStreptococcusThermophilus6032 ACA liquid core microcapsule cells,comparison fermentation effect of free cells and microcapsule cells,the different periods of the microcapsule cells wall were observed through the electron microscope,and the stability of the microcapsule cells were also ascertained.According to the Box-Behnken group and design principle based on single factor experiment,the fermentation conditions of producing Nisin by ACA liquid core microcapsule ofStreptococcusThermophilus6032 were optimized using response surface methodology.These experimental results showed that the fermentation titer of microcapsule cell was more higher than that of free cell,the fermentation stability was good in a certain period of time.With the extension of time,the microcapsule was destroyed,resulting to lower titer.The results showed that the optimal fermentation conditions were as follows: pH 6.1,the culture temperature of 28.7 ℃,the fermentation time of 20 h.Under these conditions,the titer unit of Nisin was 5 460.00 IU/mL,in which the experimental values of the titer of Nisin were closed to predicted value.These showed that it is effective for optimizing fermentation conditions of the ACA liquid core microcapsule ofStreptococcusThermophilus6032 producing Nisin using response surface methodology.

StreptococcusThermophilus; ACA liquid core microcapsule; Nisin; fermentation conditions; response surface methodology

2016-12-11

國家自然科學基金項目(59493300); 教育部博士學科點基金項目(9800462)

賀小賢(1962-)，女，陜西西安人，教授，研究方向:發酵工程、生物化工

2096-398X(2017)03-0132-06

TQ920.1

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