蘋果渣乳酸菌發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

楊 輝， 閆曉哲， 杜嬌嬌

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

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蘋果渣乳酸菌發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

楊 輝， 閆曉哲， 杜嬌嬌

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

為了充分利用蘋果渣，開發(fā)附加值高的蘋果產(chǎn)品，提升蘋果深加工水平，采用蘋果渣與新鮮蘋果復配浸提汁液，得到的浸提汁進行乳酸發(fā)酵.以總酸為主要指標對乳酸發(fā)酵菌種進行了選擇；以乳酸菌濃度為指標通過單因素實驗確立了碳源、氮源，并采用正交試驗對發(fā)酵工藝參數(shù)進行了優(yōu)化.結(jié)果表明：優(yōu)百倫發(fā)酵劑為乳酸發(fā)酵適宜菌種，其適宜發(fā)酵條件為初始pH 6.5、接種量0.4%、蔗糖添加量3%、玉米漿添加量0.5%，在此條件下，所得乳酸醪液單位體積活菌數(shù)含量大于9.43×108CFU/mL，發(fā)酵液總酸含量大于7.74 g/L,有利于乳酸飲料的生產(chǎn)與開發(fā).

蘋果渣； 乳酸菌發(fā)酵； 發(fā)酵劑； 乳酸菌； 活菌數(shù)； 總酸

0 引言

中國是蘋果種植大國,占世界的40%以上[1]，果汁生產(chǎn)中果渣產(chǎn)量達到蘋果總量的20%～ 30%.據(jù)調(diào)查，這些果渣除15%～20%用作燃料，約10%做飼料外，70%被廢棄.大量的廢棄果渣不但嚴重污染環(huán)境，還造成蘋果資源的浪費.如能對果渣資源進行開發(fā)利用，不僅可以減少廢棄物的排放，而且能增加果品的附加值，增加果業(yè)的經(jīng)濟效益[2].

乳酸是乳酸菌發(fā)酵的主要產(chǎn)物，能抑制有害微生物的繁殖；能夠促進胃腸蠕動；提高鈣、磷、鐵、維生素D的吸收利用率；可賦予發(fā)酵飲料純樸的酸味和清爽的風味，增加產(chǎn)品的爽口性.近年來，隨著果蔬業(yè)的發(fā)展，果蔬乳酸飲料的研究成為發(fā)酵飲料的研究熱點之一.張云濤等[3]、李冰[4]、高晗[5]對紅棗汁乳酸發(fā)酵飲料進行了研究；王立霞[6]對和田玉棗乳酸發(fā)酵關鍵技術進行了研究；鄭瑞婷等[7]、王曉晴等[8]對獼猴桃汁乳酸發(fā)酵飲料加工工藝進行了研究；王健等[9]對莜麥乳酸發(fā)酵飲料制備工藝進行了研究.

蘋果渣含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì)，它們具有抗氧化性、降低膽固醇和減肥的作用，因而是生產(chǎn)乳酸飲料的適宜原料，本文對蘋果渣乳酸發(fā)酵工藝進行了研究，乳酸發(fā)酵中培養(yǎng)基成分是影響發(fā)酵的重要因素，國內(nèi)外對于乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基的研究較多，李想等[10]以MRS培養(yǎng)基為對照對植物乳桿菌碳、氮和磷源進行了篩選和優(yōu)化，結(jié)果得到酵母膏為植物乳桿菌的適宜氮源；李文友等[11]以玉米漿代替酵母粉、豆粕水解液、生物素為氮源，對L-乳酸發(fā)酵進行了研究，結(jié)果表明以玉米漿代替酵母粉等為有機氮源發(fā)酵L-乳酸是可行的，而且降低了乳酸的生產(chǎn)成本；高年發(fā)等[12]、于雷等[13]也對乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，也得到了用玉米漿代替酵母粉是可行的；潘麗軍等[14]以豆粕水解液為氮源，對細菌乳酸發(fā)酵基礎培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，得到了相似的結(jié)論——玉米漿可用于乳酸發(fā)酵.

上述培養(yǎng)基優(yōu)化中采用的菌種并非本研究所采用的菌種和原料，故本實驗采用蘋果渣為原料，通過添加不同的氮源和碳源對果渣培養(yǎng)基進行優(yōu)化，企圖尋找一種有利于乳酸菌發(fā)酵的蘋果渣培養(yǎng)基，為利用果渣生產(chǎn)一款乳酸菌功能飲料打下基礎，同時解決果渣所帶來的環(huán)境問題，為果農(nóng)增加經(jīng)濟效益.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

旬邑紅富士蘋果：市售、成熟度好、無蟲害、無機械損傷；果渣：新鮮蘋果榨取的果渣，氧化程度低；Vc，蔗糖(食品級)，果膠酶(食品級).

1.2 菌種

嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、酸奶發(fā)酵劑(嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌混合菌種)：優(yōu)百倫生物科技有限公司.

1.3 培養(yǎng)基

MRS[15]肉湯培養(yǎng)基(一級培養(yǎng)基)： 蛋白胨10 g、酵母粉5 g、檸檬酸二銨2 g、葡萄糖20 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、牛肉膏10 g、K2HPO42 g、乙酸鈉5 g、吐溫-80 1 mL、MgSO4·4H2O 0.25 g、瓊脂粉15～20 g,蒸餾水1 000 mL.

生產(chǎn)培養(yǎng)基：蘋果果渣果漿浸提液.

1.4 設備與儀器

恒溫培養(yǎng)箱(山東濰坊醫(yī)療器械廠),pH儀(成都市方舟科技開發(fā)公司),電子分析天平(賽多利斯(北京)科技有限公司),電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司),超凈工作臺(蘇州凈化設備工作廠),榨汁機(廣東美的精品電器制造有限公司),滅菌鍋(江陰濱江醫(yī)療設備有限公司).

1.5 實驗方法

1.5.1 乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

取新鮮果渣40 g和新鮮切塊的蘋果30 g混合打漿，加入0.1%VC溶液[16]護色，按料液比7∶3(W∶V)加入30 mL蒸餾水進行浸提，90 ℃～92 ℃滅菌20 min，待冷卻后添加0.6 g/L的果膠酶，常溫下酶解4 h，過濾得到澄清浸提液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和碳酸鈉調(diào)整浸提液pH后,加入定量的蔗糖和玉米漿補充碳源、氮源，接入相應菌種，在40 ℃下發(fā)酵至總酸基本不變，結(jié)束發(fā)酵，并測定發(fā)酵液中活菌數(shù)、總酸含量.

1.5.2 菌種的選育

利用實驗室已有菌種，在適宜的條件下將乳酸菌接入果渣浸提液中，發(fā)酵至總酸基本不變，測定發(fā)酵前后總糖、總酸含量的差值并計算轉(zhuǎn)化率.選取總糖消耗高、產(chǎn)酸多、產(chǎn)率高的菌株或者發(fā)酵劑作為實驗生產(chǎn)菌種.

1.5.3 單因素實驗

將浸提液經(jīng)過滅菌后接入乳酸菌進行發(fā)酵，以總酸、轉(zhuǎn)化率為考量指標， 確定合適的發(fā)酵菌種，考察接種量、初始pH、蔗糖添加量、玉米漿添加量對發(fā)酵的影響.實驗方案：乳酸菌接種量選為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%；初始pH為5.5、6.0、6.5、6.7、7.0；在蔗糖、乳糖、葡萄糖、淀粉中選擇一種較佳的碳源，并設置添加梯度1%、2%、3%、4%、5%尋找較佳添加量；在蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、硝酸鈉、尿素選擇一種較佳氮源，并設置添加梯度0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%尋找較佳添加量；以發(fā)酵液中活菌數(shù)為主要指標，總酸含量為參考指標，確定各個因素的范圍.

1.5.4 正交試驗

依單因素實驗結(jié)果，接種量(A)，碳源用量(B)，氮源用量(C)，選初始pH(D)為因素，每個因素選取3水平，按L9(43)設計正交試驗方案(以發(fā)酵結(jié)束時活菌數(shù)為考察指標).

1.5.5 檢測方法

總酸按國標GBT 12456-2008方法測定；總糖按國標GBT 15038-2006方法測定；發(fā)酵液中活菌數(shù)按國標GB 47893-2010方法測定.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種選取

圖1給出了不同菌種發(fā)酵產(chǎn)酸情況.本實驗中采用的發(fā)酵劑有鏈球菌屬和桿菌屬的乳酸菌，其中嗜熱鏈球菌分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生甲酸和丙酸促進了桿菌的生長，桿菌在發(fā)酵過程中釋放的物質(zhì)是鏈球菌基本的生長因素，使球菌生長較快，形成了共生現(xiàn)象.菌種之間協(xié)同發(fā)酵使菌種活力更加旺盛，產(chǎn)酸量大幅度提高，有利于發(fā)酵[17].本實驗將采用混合菌種進行發(fā)酵.

圖1 不同乳酸菌種發(fā)酵產(chǎn)酸情況

2.2 接種量對發(fā)酵的影響

圖2給出采用混合乳酸菌發(fā)酵時，接種量對發(fā)酵醪中活菌數(shù)的影響.結(jié)果表明,隨著接種量的增加，活菌數(shù)升高，接種量持續(xù)升高導致發(fā)酵結(jié)束時的活菌含量較低.研究表明,接種量大小影響乳酸脫氫酶的含量[18]，如果接種量過小，乳酸脫氫酶含量較低，導致發(fā)酵時間延長，接種量過大導致營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，培養(yǎng)液黏度增大，菌體早衰，發(fā)酵后勁不足，影響發(fā)酵產(chǎn)量.本研究結(jié)果與此一致，圖2表明接種量為0.4 g/100mL時發(fā)酵液中活菌含量約2.0×108CFU/mL，當接種量增加為1.0 g/100 mL時，發(fā)酵液中活菌含量約為0.2×108CFU/mL相差10倍，菌體早衰嚴重，因此，較佳接種量為0.4 %.

圖2 接種量對乳酸發(fā)酵液中活菌數(shù)的影響

2.3 發(fā)酵初始pH對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響

由圖3可知，當初始pH為6.5時，發(fā)酵結(jié)束時的活菌數(shù)最大，有利于發(fā)酵.細菌細胞膜表面具有H+-ATPase，將H+泵出細胞，建立和維持跨膜的H+電化學梯度，并驅(qū)動轉(zhuǎn)運溶質(zhì)攝入細胞，細胞對糖和氨基酸的攝入主要是由H+驅(qū)動的同向運輸完成的[19].培養(yǎng)液pH動態(tài)變化主要是由乳酸菌在生長過程中產(chǎn)生乳酸引起的，乳酸的積累影響乳酸菌的生長.乳酸是一種解偶聯(lián)劑，起到使質(zhì)子從培養(yǎng)液中進入細胞的質(zhì)子泵作用，因此隨著乳酸的積累，胞外與胞內(nèi)的pH均下降，進而抑制乳酸菌的生長[20].當細胞內(nèi)pH值下降，抑制了乳酸脫氫酶的活性，從而抑制了糖代謝途徑，影響了菌體能量的獲得，抑制了菌體的生長[21].而pH高于6.5時，培養(yǎng)基中缺乏H+，糖、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，缺乏進入細胞的推動力，導致細胞生長不良.

圖3 初始pH對乳酸發(fā)酵液中活菌數(shù)的影響

2.4 碳源種類對發(fā)酵活菌數(shù)的影響

不同乳酸菌細胞存在不同的酶系，利用的優(yōu)勢碳源亦不同.由圖4可知,本實驗選用的混合乳酸菌選白砂糖作為碳源更適合發(fā)酵.在發(fā)酵過程中白砂糖的含量起著關鍵作用，如果白砂糖濃度過低，不能為微生物提供充足的碳源，細菌生長慢導致乳酸產(chǎn)量低.但是若糖濃度過高，使培養(yǎng)基的滲透壓增大從而抑制了菌體的生長，這種基質(zhì)抑制作用導致乳酸合成也受到了影響[18].由圖5可以看出，當白砂糖添加量為4 g/100 mL時有最大的活菌數(shù).

圖4 碳源種類對發(fā)酵活菌數(shù)的影響

圖5 白砂糖對乳酸發(fā)酵液中活菌數(shù)的影響

2.5 氮源對發(fā)酵活菌數(shù)的影響

由于一般乳酸菌生長及其合成氨基酸、維生素、核苷酸等的能力較差，在它們的培養(yǎng)基中需要添加一定的氮源來滿足它們的生長.氮源種類較多，硝酸鈉為無機氮源不能滿足要求，尿素雖為有機氮，但其成分單一，不具有有機氮的特點[13]，蛋白胨含有多種氨基酸和多肽，含糖量較低，牛肉膏中含有肌酸、肌酸酐、多肽類、氨基酸類等物質(zhì)，玉米漿中含有大量的氨基酸、維生素、生長因子，可促進菌體生長、有利于發(fā)酵產(chǎn)酸、提高糖酸轉(zhuǎn)化率[22].從圖6可以看出，與蛋白胨、牛肉膏相比，玉米漿更適合本實驗采用的乳酸菌生長發(fā)育，而且玉米漿成本較低.

圖6 氮源種類對乳酸發(fā)酵活菌數(shù)的影響

從圖7可以看出，當玉米漿含量增加時體系的營養(yǎng)物質(zhì)增加，菌體濃度增加，產(chǎn)酸量增加.保持碳源一定的情況下，在發(fā)酵液中進一步添加玉米漿，營養(yǎng)物質(zhì)增加，發(fā)酵前期菌體繁殖速度加快，同時，碳源在前期迅速減少，后期碳源不足，菌種代謝受阻，繁殖緩慢.圖7表明玉米漿添加量為1.0 mL/100 mL時，活菌數(shù)量較高.

圖7 玉米漿添加量對發(fā)酵液中活菌數(shù)的影響

2.6 正交試驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，設計三水平正交實驗，其因素水平表如表1所示.

表1 蘋果乳酸發(fā)酵正交試驗因素及水平

表2和表3分別為蘋果渣乳酸發(fā)酵正交試驗結(jié)果和方差分析.研究表明,蘋果渣乳酸發(fā)酵條件適宜組合為A2B2C1D2，即接種量0.4 g/100 mL、蔗糖添加量3 g/100 mL、玉米漿添加量0.5 g/100 mL、 pH 6.5.影響因素順序為A﹥D﹥B﹥C，即接種量影響最大，其次是pH值，隨后是蔗糖添加量，最后是玉米漿添加量.

按照發(fā)酵乳酸菌接種0.4 g/100 mL、蔗糖添加量3 g/100 mL、玉米漿添加量0.5 mL/100 mL、初始pH 6.5， 做三平行驗證性實驗，結(jié)果表明在此條件下發(fā)酵，結(jié)束時發(fā)酵醪液中乳酸活菌數(shù)可達9.43×108CFU/mL，總酸含量為7.74 g/L.

表2 蘋果乳酸發(fā)酵正交試驗結(jié)果

3 結(jié)論

以蘋果渣和鮮蘋果為原料進行乳酸發(fā)酵，優(yōu)百倫為適宜發(fā)酵劑，蔗糖為適宜碳源，而適宜氮源為玉米漿，優(yōu)化后的發(fā)酵工藝條件為：初始pH 6.5，乳酸菌接種0.4 g/100 mL，蔗糖添加量3 g/100 mL、玉米漿添加量0.5 mL/100 mL，在此條件下所得發(fā)酵液中活菌數(shù)為9.43×108CFU/mL，總酸為7.74 g/L，有利于乳酸飲料的生產(chǎn).

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【責任編輯：陳 佳】

Optimization of apple residuelactobacillusfermentation

YANG Hui， YAN Xiao-zhe， DU Jiao-jiao

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science &Technology, Xi′an 710021, China)

In order to make full use of the apple pomace and improve the level of apple deep processing,the apple pomace and fresh apple were used as materials to extract juice in aqueous solution.Then,the extracted juice was fermented byLactobacillusto prepare a lactic acid solution.Based on criteria including total acid content and cell concentration,an ideal lactic acid bacteria was screened.And the ideal carbon source and nitrogen source for selected lactic acid strain were determined by single factor experiments based on a criteria of cell concentration.The fermentation parameters were optimized by orthogonal test design.Results show that the idea inoculums for lactic acid fermentation is yoghurt starter.The optimal fermentation conditions are the initial pH of 6.5,inoculum size of 0.4%,sucrose content 3%,corn steep liquor 0.5%.Under the conditions,the cell concentration ofLactobacilluswas more than 9.43×108CFU/mL and the total acid content is more than 7.74 g/L in the fermentation broth,which is favorite to production and development of lactic acid beverage.

apple pomace; lactic acid fermentation; fermentation starter;Lactobacillus; viable count; total acid

2016-10-29

科技部成果轉(zhuǎn)化項目(2013GB2G000473)； 陜西科技大學學術帶頭人團隊項目(2013XSD19)

楊 輝(1960-)，男，陜西西安人，教授，博士生導師，研究方向：生物材料和發(fā)酵工程

2096-398X(2017)03-0138-05

TS255.2

A