地膚子乙醇提取物對自由基清除能力的對比研究

王 靜， 侯 令， 張 華， 張 悅， 陳雪峰

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

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地膚子乙醇提取物對自由基清除能力的對比研究

王 靜， 侯 令， 張 華， 張 悅， 陳雪峰*

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

自由基引起氧化損傷，但由于自由基種類和含量的差別，抗氧化劑的開發應具有針對性.前期研究發現地膚子提取物具有抗氧化活性，且醇提物抗氧化活性優于水提物，本研究進一步比較不同濃度乙醇(40%，50%，60%)提取物對·OH、DPPH·和ABTS+·三種不同自由基的清除能力，并分析自由基清除率與總皂苷含量的關系.結果表明，40%、50%、60%乙醇提取物對三種自由基的清除能力存在差異，且同一濃度醇提物對不同自由基的清除率也完全不同.隨乙醇濃度增加，DPPH·清除率升高，·OH清除率卻降低；60%醇提物總皂苷是40%醇提物總皂苷含量的3倍，但羥基清除率卻低于30%.60%醇提物總皂苷含量最高但對ABTS+·清除率卻最低.該研究可用于正確篩選抗氧化劑并有針對性地開發地膚子.

地膚子；乙醇提??；自由基; 抗氧化；總皂苷

0 引言

自由基是含有一個不成對電子的原子，機體通常產生一定量的自由基可作為信號分子參與正常生理代謝，但過量的自由基則會導致機體氧化還原失衡，造成氧化損傷，引發病理反應[1,2].現代人由于生活壓力大、環境污染等因素都使得人體更容易產生過量的自由基.此外，自由基種類和含量也有很大差別，如攻擊人體的自由基主要屬于活性氧自由基.因此，研究和開發自由基清除物質應具有針對性.

從植物中提取的具有抗氧化活性的物質，如天然多酚類、黃酮類、植酸、皂苷等已被證明具有良好的清除自由基活性.這些天然成分不但抗氧化效果明顯，而且取材方便，對人體沒有毒性[3,4]，因此，天然植物提取物的研究應用已成為當今食品添加劑研究領域的熱點之一.

地膚子俗稱掃帚菜，主產于陜西、青海、四川、河北、山西、山東、遼寧等地.地膚子的嫩莖和嫩葉可食，是一種高蛋白、低脂肪的野生蔬菜，其成熟果實的種籽作為食用油對人體的健康十分有益[5,6].據報道，地膚子提取物具有降血糖，抑制化學性肝損傷等功能活性[7,8].作者前期也發現，地膚子水提物和50%乙醇提取物具有抗氧化作用[9]，且醇提物抗氧化活性優于水提物，但對其自由基清除活性的研究尚不深入.因此，本研究在前期基礎上，采用不同濃度乙醇提取，進一步對比其對目前廣泛用于試驗研究的·OH、DPPH·和ABTS+·三種不同自由基的清除能力[10]，并分析總皂苷含量對清除率的影響.一方面為地膚子抗氧化功能的研究提供借鑒，另一方面也為地膚子的提取工藝和相關應用提供理論指導.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地膚子粉末；無水乙醇、無水甲醇、DPPH、ABTS、K2S2O8、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸(以上試劑均為分析純)、香草醛、冰乙酸、高氯酸、齊墩果酸.

1.2 儀器與設備

真空泵，鞏義予華儀器有限責任公司；冷凍干燥機，上海比朗儀器有限公司；超聲波清洗機，蘇州昆山超聲儀器有限公司；移液槍，LABNET公司；電子天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司；紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；離心機，上海天美科學儀器有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 地膚子醇提物的制備[11]

準確稱取2 g地膚子粉末于錐形瓶中，分別添加20 mL的(40%、50%、60%)乙醇溶液，置于已70 ℃恒溫震蕩水槽中提取4 h后，取出并抽濾樣品.將濾液冷凍干燥，得到地膚子醇提物粉末，試驗時，用相應濃度的(40%、50%、60%)乙醇溶液將其溶解.

1.3.2 DPPH自由基清除試驗[12]

準確稱取5 mg地膚子乙醇提取物粉末于50 mL容量瓶中，溶解后定容至50 mL，即為10 mg/mL的地膚子乙醇提取物溶液，再以此溶液稀釋為1、3、5、7、9 mg/mL的地膚子乙醇提取物梯度液.

準確稱取15 mg的DPPH于200 mL容量瓶中，用無水甲醇定容，配制濃度為200μmol/L的DPPH甲醇溶液.試驗組分別往小試管中加入2 mL樣品，再加入3 mL 200μmol/L的DPPH甲醇溶液，漩渦震蕩混合，避光靜置30 min，517 nm測定其吸光度.空白組用水代替樣品，對照組用甲醇代替DPPH甲醇溶液.按公式1計算DPPH自由基清除率.

C=[1-(A1-A2)/A0]×100

(1)

式(1)中：C為自由基清除率，A1為試驗組(加樣品和試劑)吸光度值，A2為對照組(未加試劑)吸光度值，A0為空白組(未加樣品)吸光度值.

1.3.3 ABTS+自由基清除試驗[13]

(1)ABTS+自由基儲備液的配置

①10 mL的7 mmol/L的ABTS溶液(A)：稱取ABTS 0.038 41 g溶于10 mL蒸餾水中；

②7.35 mmol/L的K2S2O8溶液(B)：稱取K2S2O8粉末0.009 93 g溶解于5 mL蒸餾水中；

將A和B混合，在室溫下避光放置16 h形成ABTS+自由基儲備液.ABTS使用前用無水乙醇稀釋成工作液，要求稀釋到30 ℃，734 nm波長下的吸光度為0.70±0.02.經試驗得當儲備液稀釋度為80倍時其吸光度為0.700 1，滿足要求.吸取8.333 mL ABTS+自由基儲備液，用無水乙醇定容至500 mL備用.

(2)樣品的測定

樣品制備和稀釋同上.試驗組分別往小試管中加入1 mL樣品，再加入5 mL的ABTS工作液，漩渦振蕩后，室溫反應6 min，于734 nm波長下測定其吸光度.

空白組用水代替樣品，對照組用水代替ABTS工作液.參照公式1計算樣品對自由基的清除率.

1.3.4 羥自由基清除活性的測定[12]

(1)試劑的配置

①6 mmol/L的FeSO4溶液：稱取FeSO40.091 2 g溶于100 mL蒸餾水中；

②2.5 mmol/L的H2O2溶液：取30%的H2O2溶液0.026 mL用水定容至100 mL容量瓶中；

③6 mmol/L的水楊酸溶液：稱取0.082 8 g水楊酸，用無水乙醇定容至100 mL容量瓶中.

(2)樣品的測定

H2O2和Fe2+混合發生Fenton反應，生成具有很高反應活性的羥自由基，羥自由基能被水楊酸有效捕獲，并生成有色物質；若加入具有清除作用的物質，便會與水楊酸競爭，有色產物的生成量減少.向試管中加入不同濃度的提取物2 mL(空白組不加)，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL(對照組不加)、2.5 mmol/L H2O2溶液2 mL(對照組不加)，搖勻，靜置10 min，再加入6 mmol/L水楊酸乙醇溶液(對照組不加)2 mL，加水定容至10 mL，搖勻，37 ℃水浴30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液測定OD510nm值.參照公式1計算羥自由基清除率.

1.3.5 總皂苷含量分析

(1)標準曲線的繪制

由于地膚子總皂苷是三萜類化合物，與齊墩果酸結構相似，故選取苷元類似物齊墩果酸作為標準品.精確稱取2.0 mg干燥至恒重的齊墩果酸對照品置于10 mL容量瓶中，95%乙醇溶解，并定容至刻度，搖勻得濃度為0.2 mg/mL的對照品儲備液.

分別吸取齊墩果酸對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL于10 mL具塞試管中，75 ℃左右水浴蒸干，于試管中加人新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，置60 ℃水浴上加熱20 min，流水冷卻，加冰醋酸5 mL，搖勻，以分光光度計在550 nm波長處測定吸光度，以不加樣品組為對照，扣除試劑背景值.以相應具塞試管中齊墩果酸含量(mg)為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線.

(2)地膚子總皂苷含量的測定

取一定量的提取液于具塞試管，水浴揮干，按標準曲線繪制中的顯色方法測定待測總皂苷提取液的吸光度值，由標曲計算地膚子總皂苷的含量.

1.3.6 統計學分析

所有試驗均重復3次，計算平均值，試驗數據表示：平均值±標準差.

2 結果與討論

2.1 不同醇濃度制備的提取物對同種自由基清除能力的對比分析

2.1.1 DPPH自由基

圖1表明不同濃度乙醇提取物都具有清除DPPH自由基的能力，且在一定濃度范圍內，隨提取物濃度的增加，DPPH自由基的清除率也隨之增加.但當濃度增加到一定量后，自由基清除率便不再增加；并且在一定濃度范圍內，隨著乙醇濃度的增加，清除DPPH自由基的能力也隨之增強.40%、50%和60%乙醇提取物之間的清除率差別不大(0%～10%).

圖1 地膚子乙醇提取物對DPPH自由基的清除率

2.1.2 羥自由基

圖2顯示提取物都具有一定的清除羥自由基的能力.不同于DPPH自由基清除體系的是，在一定濃度范圍內，隨著乙醇濃度的增加，清除羥自由基的能力隨之降低.60%乙醇提取物最大清除率比40%乙醇提取物最大清除率低約30%.不同濃度乙醇提取物最大清除率差別不大.

圖2 地膚子乙醇提取物對OH自由基的清除率

2.1.3 ABTS+自由基

由圖3可知，提取物清除ABTS+自由基的變化比較復雜，乙醇濃度為40%和50%得到的提取物，在一定濃度范圍內，隨提取物濃度增大，對ABTS+自由基的清除活性增強；但最大清除率差別僅有10%作用.乙醇濃度為60%的提取物隨提取物濃度增大，清除率先增加隨后迅速下降.此外，當乙醇濃度為50%時，地膚子提取物對ABTS+自由基的清除效果最好.60%乙醇提取物最大清除率比50%乙醇提取物最大清除率低20%左右.

圖3 地膚子乙醇提取物對ABTS+自由基的清除率

2.2 不同醇濃度制備的提取物對不同自由基清除能力的對比分析

圖4、圖5顯示同一濃度的乙醇(40%或50%)提取物清除ABTS+自由基的效果最好，對DPPH自由基的清除效果次之，羥自由基清除效果最差；但均能有效清除三種自由基.而分析圖6發現，60%乙醇提取物濃度增加到5 mg/mL之后，ABTS+自由基清除率能力不斷下降，而羥自由基清除率僅達到50%左右，DPPH自由基的清除效果最好.

圖4 40%醇提物對不同自由基的清除率

圖5 50%醇提物對不同自由基的清除率

圖6 60%醇提物對不同自由基的清除率

2.3 提取物總皂苷含量分析

據報道,地膚子含有一定量的皂苷[14,15]，植物皂苷具有廣泛的抗氧化活性[16,17]，因此本研究測定了三種不同濃度乙醇提取物中總皂苷含量，如圖7所示.結果發現，隨著乙醇濃度的增加，提取物總皂苷含量增加；但是綜合前文對自由基清除活性的分析，皂苷含量并不與自由基清除率呈正相關.

(a)標準曲線

(b)總皂苷含量圖7 乙醇提取物中總皂苷含量

羥自由基(·OH)是生命活動代謝中不斷產生的一種活性氧自由基(ROS).·OH氧化能力強，氧化效率高，反應速率快，極易氧化各種有機物和無機物，造成組織脂質過氧化、核酸斷裂、蛋白質和多糖分解，與機體的衰老和疾病密切相關.人體內約95%以上的自由基中屬于活性氧自由基，因此活性氧自由基的研究對人體有特殊意義[18,19].本研究發現,40%、50%、60%乙醇提取物均能清除羥自由基，但40%乙醇制備的提取物清除能力最強.植物皂苷具有一定的抗氧化活性[20,21]，但是經測定發現，60%乙醇提取物總皂苷是40%乙醇提取物總皂苷含量的3倍，但羥基最大清除率卻低30%，這些結果表明皂苷可能對羥基的清除能力有限，而地膚子乙醇提取物中可能存在其它能有效清除羥基的活性成分，而隨著乙醇濃度的增加，提取成分及活性發生變化，導致羥基清除效果變差.

有趣的是，DPPH自由基的變化趨勢與羥基體系相反.提取物能有效清除DPPH自由基且清除能力隨著乙醇濃度增加而提高，清除率變化和總皂苷含量呈正相關，但各濃度乙醇提取物的清除率相差很小.這些結果顯示地膚子提取物對DPPH自由基有很強的清除能力，且該清除能力很大程度上歸于總皂苷的活性.

研究發現,50%乙醇提取物對于ABTS+自由基的清除效果強于40%提取物，但二者清除率差別不大，同時也發現，二者的總皂苷含量差別也很小，表明地膚子提取物對ABTS+自由基也有良好的清除能力，且與皂苷的抗氧化能力有一定關系.但是有趣的是，60%乙醇提取物總皂苷含量最高而ABTS+自由基清除率卻最低，且清除率呈先增加后大幅下降的趨勢，這種現象出現的原因目前還不明了，有可能是高濃度乙醇提取物中含有某種結構或活性復雜易變的成分[22]，對ABTS+自由基的清除效果不太穩定，但具體問題還有待深入研究.

3 結論

綜上所述，地膚子乙醇提取物對羥基，DPPH和ABTS+自由基均有一定的清除能力.然而乙醇濃度增加，雖然使得地膚子總皂苷含量提高，但并不增加對各類自由基的清除活性.40%和50%乙醇制備的提取物自由基清除活性更強.此外，皂苷含量并不與自由基清除活性呈正相關，也暗示地膚子乙醇提取物成分的復雜，需進一步深入研究.本研究不僅有助于正確篩選抗氧化劑和進一步探究地膚子提取物的用途，且對地膚子有針對性的應用于食品抗氧化劑而言也是有價值的，它為地膚子在食品保健品方面的開發應用提供了參考.

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【責任編輯：蔣亞儒】

Study on comparison of free radical scavenging activities in the ethanolKochiascopariaextract

WANG Jing， HOU Ling， ZHANG Hua， ZHANG Yue， CHEN Xue-feng*

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Free radicals-induce oxidized injury should be studied contrapuntally due to the differences of radicals species and contents.We previously foundKochiascopariaextracts showed good anti-oxidant activity and ethanol extracts showed higher capacity than water extracts.In this paper,free radical scavenging activities (DPPH· and ABTS+· and hydroxyl radical) of different concentrations(40%,50%,60%)of ethanol extracts fromKochiascopariawere compared,and the total saponins were also considered.We found that different ethanol extracts showed differences between free radicals scavenging capacity,and each extracts exerted greatly different scavenging effect on these radicals.As ethanol concentration increased,DPPH· scavenging activities increased while hydroxyl radicals scavenging activities decreased.The total saponins content of 60% ethanol extracts is 3 times higher than that of 40% ethanol extracts,but the hydroxyl radicals scavenging activities are lower by 30%.The 60% ethanol extracts showed the highest content of total saponins but exerted lowest scavenging capacity.These conclusions may provide more evidence for antioxidants selection andKochiascopariadevelopment.

Kochiascoparia; ethanol extract; free radicals;antioxidant; total saponin

2017-01-25

陜西科技大學博士科研啟動基金項目(2016BJ-06)

王 靜(1987-)，女，陜西咸陽人，講師，博士，研究方向：食品因子功能活性及其作用機制

陳雪峰(1964-)，男，四川武勝人，教授，博士生導師，研究方向：食品功能成分， liwangwangjing@126.com

2096-398X(2017)03-0148-05

TS218

A