人小涎腺間充質干細胞與骨髓間充質干細胞的增殖和成脂比較

曹 蕊，嚴 笠，張 辰，孫雪健，趙振民

人小涎腺間充質干細胞與骨髓間充質干細胞的增殖和成脂比較

曹 蕊，嚴 笠，張 辰，孫雪健，趙振民

（中國醫學科學院整形外科醫院研究中心 北京 100144）

目的：通過對人小涎腺干細胞（human Minor Salivary Gland Mesenchymal Stem Cells, hMSGMSCs)與人骨髓間充質干細胞（human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,hBMSCs)的增殖、活力、凋亡以及成脂分化能力等生物學特性的比較，證實小涎腺干細胞具有高度自我更新能力并具有向脂肪細胞分化的潛能，為其成為新型的理想種子細胞提供理論基礎。方法：提取臨床患者的hMSGMSCs和hBMSCs各3例，利用MTS細胞增殖與毒性檢測試劑盒，檢測兩種細胞的490nm吸光度值（optical density，OD490nm）的變化并繪制增殖曲線，比較兩種細胞的增殖能力；利用MUSE細胞分析儀檢測兩種細胞的活力和凋亡，并加以比較；對兩種細胞進行成脂誘導，2周后油紅O染色，鏡下觀察及用異丙醇溶解成脂細胞吸附的油紅O染料，檢測OD490nm，比較脂滴形成情況。結果：hMSGMSCs 比hBMSCs具有更強的增殖能力（P＜0.05），將其傳至30代仍很好地保持細胞的活性；兩種干細胞活力及凋亡情況檢測無明顯差異(P＞0.05)；兩種細胞成脂誘導2周后OD490nm無明顯差異（P＞0.05）。結論：hMSGMSCs 將有望成為理想的種子細胞，應用于細胞治療和再生醫學研究。

小涎腺干細胞；骨髓間充質干細胞；細胞增殖曲線；凋亡；成脂誘導

人成體干細胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞，在合適的條件下或給予合適的信號，可以分化成多種功能細胞或組織器官用于治療多種傳統方法難以治愈的疾病。人骨髓中存在一定量的hBMSCs，能夠在一定條件下分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞等，相關研究報道證實其為理想的種子細胞來源[1-3]。但因取材較為困難，創傷大，獲得的細胞數量有限，因此研究者陸續從其它組織中尋找間充質干細胞。近年來，已有研究證實大唾液腺組織中含有間充質干細胞,可作為種子細胞，應用于細胞治療和再生醫學研究[4-8]。本課題組已成功從小涎腺中提取成纖維樣細胞，并對其進行流式細胞學和免疫相關標志物檢測，證實hMSGMSCs強表達間充質干細胞的標志物[9-10]。本次研究主要是對小涎腺干細胞和骨髓干細胞的一些生物學特性做比較，進一步證實hMSGMSCs具有很強的自我復制能力并具有良好的成脂分化潛能，可為今后的細胞治療提供理想的種子細胞。

1 材料和方法

1.1 材料：hMSGMSCs來源于3例中國醫學科學院整形外科醫院唇部手術需要切除的小涎腺組織，3例hBMSCs同樣來源于本院的髂骨松質骨切取時髂骨傷口內流出的骨髓血組織，患者平均年齡10歲，無腺體相關疾病和自身免疫性疾病病史。本研究所使用樣本均獲患者知情同意，經醫學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑和儀器：DMEM 高糖培養基（Gibco)、胎牛血清（Gibco)、青鏈霉素（Hyclone)、胰蛋白酶（Hyclone)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）（Sigma）、胰島素（Sigma)、吲哚美辛（Sigma)、地塞米松（Sigma)、主要儀器：二氧化碳孵箱(美國Thermo)、倒置顯微鏡(Nikon TE2000-S)、酶標儀（Enspire）、生物電脈沖分析儀（Muse Cell Analyer）、流式細胞儀(BD FACSAriaTMⅡ Cell Sorter)。

1.3 培養基配方：①普通完全培養基：DMEM 高糖、10%胎牛血清、1%青鏈霉素；②成脂誘導液(100ml)；DMEM高糖、10%胎牛血清、1%青鏈霉素、IBMX0.5mmol/L、胰島素10μmol/L、吲哚美辛200μmol/L、地塞米松10nmol/L。

1.4 實驗方法

1.4.1 hBMSCs體外分離培養：臨床上手術中收集從髂骨傷口內流出的5ml骨髓血采用淋巴細胞分離液梯度離心提取骨髓間充質干細胞，將5ml骨髓血沿管壁緩慢加入到已有等體積淋巴細胞分離液的離心管內，離心15min，1500rpm，小心吸取上中層交界處的白色絮狀層，即單核細胞層，放入另一個離心管中，用等體積無血清培養基洗滌2次（每次離心5min，1500rpm），輕輕吸除上清液，加入10%FBS DMEM約5ml，制成細胞懸液，接種培養，3d后換液。細胞匯合至80%后1:2或1:3傳代。

1.4.2 hMSGMSCs的體外分離培養：將采集到的小涎腺組織標本轉移到培養皿中，用冷的PBS洗兩遍，盡量去除分泌液。用眼科剪和眼科鑷去除多余的結締組織，分離出完整的小涎腺。吸去培養皿中的全部液體，用眼科剪將其剪成大約0.5mm3的小塊，操作過程中避免組織過度干燥。用眼科鑷將剪碎的組織塊均勻鋪在T25培養瓶的底部，每個組織塊間距5mm，小心放入完全培養基后豎立放于37℃,5%CO2培養箱中，6h后組織塊貼附于瓶底時慢慢放倒培養瓶，使組織塊完全浸在完全培養基中。接種4d后換液，棄去未貼壁的組織塊。之后每3d換液一次。細胞匯合至80%后1:2或1:3傳代。

1.4.3 對hMSGMSCs細胞表面標志物進行流式細胞學檢測：將第5代hMSGMSCs細胞消化至單細胞懸液，1 000rpm離心5min，棄上清，加PBS重懸，再重復本步驟一次。細胞計數后，用Staining Buffer重懸細胞至106/100μl，分裝至1.5ml離心管中，100μl/管。根據抗體說明書加入抗體，避光冰上孵育30min。每管添加1ml Staining Buffer吹打細胞，離心300g，5min，棄上清，重復本步驟，棄上清后每管細胞重懸于300μl Staining Buffer，2h內上機檢測。

1.4.4 hBMSCs和hMSGMSCs的生長曲線的比較：將第5代的兩種細胞消化后分別計數，接種于96孔板中，每孔加入200μl細胞懸液，約2 000個/孔，共計每種細胞接種21孔。細胞接種第2天開始，每天選擇3孔吸除上清液后，加入無血清培養基100μl，再采用細胞增殖與毒性檢測試劑盒（CellTiter 96? Aqueous One Solution Assay），加入甲臢化合物3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁），內鹽（MTS）溶液20μl，搖勻后37℃孵育4h，在酶聯免疫檢測儀上測定每孔在490nm波長的光密度值（OD值）。連續檢測7d，繪制生長曲線，未檢測的細胞3d換液一次。

1.4.5 hMSGMSCs和 hBMSCs細胞活力以及細胞凋亡情況的比較：取第5代同等數量的兩種細胞經胰蛋白酶消化,完全培養基終止后將細胞懸液離心,用1%FBS的PBS洗一次后，加1%FBS PBS 1ml重懸細胞，分別取兩種細胞的細胞懸液20μl加入380μl MuseTMCount ＆ Viability Cell Reagent MCH100102,輕輕吹打混勻后常溫避光孵育5min，利用Muse細胞分析儀進行細胞活力檢測。分別取兩種細胞懸液100μl加入100μl MuseTMAnnexin V ＆Dead Cell Reagent MCH100105,輕輕吹打混勻后常溫避光孵育20min，利用Muse細胞分析儀進行細胞凋亡檢測。

1.4.6 hBMSCs和hMSGMSCs成脂誘導和檢測：將第5代的hMSGMSCs和hBMSCs分別以5×104/孔各接種一個六孔板的四孔，孵育24h后將四孔分為兩組，一組兩孔是對照組，加入普通完全培養基，另一組兩孔加入成脂誘導培養基。培養14d后固定，進行油紅O染色，顯微鏡下觀察細胞成脂分化情況。以60%的異丙醇溶解染色后的成脂細胞[11]，采用酶標儀檢測490nm時的吸光度值，吸光度值與成脂細胞的多少成正比，從而對兩種細胞成脂分化能力進行比較。

1.4.7 統計學方法：采用SPSS17.0軟件，數據以均數±標準差表示，用獨立樣本t檢驗(Independ-Samples t test)對檢測結果進行統計學分析，當P＜0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hBMSCs原代及傳代細胞鏡下觀察結果：原代培養24h后細胞開始貼壁生長，貼壁細胞逐漸由圓形轉化成為長梭形，并呈集落樣分布，隨著培養時間的延長，細胞的形態方向趨于一致，漩渦樣生長，每3d換液一次，細胞匯合至90%時進行1:3傳代。細胞傳至10代后細胞生長明顯減慢，細胞狀態變差,傳代的間隔延長許多。見圖1A、圖1B。

2.2 hMSGMSCs原代及傳代細胞鏡下觀察結果：體外分離得到的1～2個小涎腺，接種于一個25cm2培養瓶，接種5～6d開始有細胞爬出，有的呈上皮樣從組織周圍爬出，也有的為成纖維樣細胞散在生長。每3d換液一次,原代培養10d左右傳第一代,用0.25%胰酶37℃消化1min,成纖維樣細胞基本全部消下來,轉移至另一個培養瓶中,從而達到兩種形態的細胞分離,傳2～3代后可得到純化的細胞,本研究對象是成纖維樣細胞。成纖維樣細胞平均每3d傳代一次，傳至30代細胞狀態良好。見圖1C、圖1D。

圖1 hBMSCs和hMSGMSCs原代及傳代細胞鏡下觀察結果

2.3 hMSGMSCs細胞表型流式細胞學檢測結果：對培養至第5代的hMSGMSCs細胞標志物進行流式細胞學檢測，結果發現hMSGMSCs高表達的表面標志物大多與間充質干細胞一致，包括：CD29、CD73、CD90、CD105和CD166，但有一個例外CD44，該標志物被認為在上皮細胞中表達。上皮細胞標志物CD49f及造血干細胞標志物CD34和CD45為陰性。見表1。

表1 hMSGMSCs流式細胞學檢測結果

2.4 細胞增殖檢測結果：采用MTS方法檢測細胞在培養24、48、72、96、120、144、168h的吸光度值（OD490nm）,結果如圖2所示，在培養72、120、144、168h后，小涎腺間充質干細胞的增殖比骨髓間充質干細胞顯著升高，差異均具有統計學意義（P72=0.0329，P120=0.0498, P144=0.0154, P168=0.0145）。

2.5 細胞凋亡檢測結果：采用Annexin V ＆ Dead Cell Reagent檢測,結果證實hMSGMSCs的凋亡細胞百分比為（23.35±3.633）%，hBMSCs的凋亡細胞百分比為（17.88±2.105）%，二者無顯著性差異(P=0.868)。見圖3。

圖3 hBMSCs和hMSGMSCs細胞凋亡檢測比較

2.6 細胞活力檢測結果：采用Count ＆ Viability Cell Reagent檢測，結果證實hMSGMSCs的活性細胞百分比為（78.45±6.809）%，hBMSCs的活性細胞百分比為（71.72±9.986）%，二者無顯著性差異(P=0.389)。見圖4。

圖4 hBMSCs和 hMSGMSCs 細胞活力檢測比較

2.7 細胞成脂誘導分化能力檢測結果：以成脂誘導培養基誘導14d后，采用油紅O染色并采用酶標儀檢測490nm時的吸光度值，結果證實hMSGMSCs在誘導后OD490nm為0.3679±0.2006, hBMSCs在誘導后OD490nm為0.2526±0.1402,二者無顯著性差異(P=0.4604)。見圖5、圖6。

圖5 hBMSCs 和hMSGMSCs成脂誘導14d后油紅O染色脂滴形成情況比較(×200)

圖6 hBMSCs和hMSGMSCs成脂誘導分化能力檢測比較

3 討論

已有文獻報道人的腮腺存在間充質干細胞,小涎腺與其組織結構和細胞成分類似，可能同樣含有此種干細胞，而且小涎腺位于口腔粘膜下，取材方便，來源豐富，切取后不影響供區的結構和功能[9，12]。目前對于人小涎腺組織中的成體干細胞的研究很少，無詳細報道。本研究已成功利用組織貼壁法從小涎腺中提取小涎腺間充質干細胞，在原代培養初期從組織周圍長出一些混雜的細胞，一種是緊密排列在組織周圍的鋪路石樣的上皮細胞，另一種是散在生長的成纖維樣細胞，通過胰酶消化時間差異將兩種細胞分離，在富含血清的完全培養基中，上皮細胞不能生長，故細胞傳至3代后就得到純化的間充質干細胞，細胞在體外擴增傳至30代時，通過對30代細胞活力的檢測證實它很好地保持了干細胞的一些增殖活性，由此可以經體外培養擴增得到足量的種子細胞。

本研究中通過hMSGMSCs細胞表型流式細胞學檢測結果可知，hMSGMSCs可強表達間充質干細胞通常表達的標記物，包括CD29、CD44、CD73、CD90、CD105以及CD166[13]，與BMSC一致；細胞增殖檢測結果顯示小涎腺來源的間充質干細胞比骨髓來源的間充質干細胞具有更強的增殖能力；細胞成脂誘導分化能力檢測結果表明二者成脂誘導分化能力無差異。且單個小涎腺原代培養的效率與5ml骨髓原代培養的效率相似[14]，因此獲得同樣多的原代細胞需要的小涎腺組織量較少。相關研究表明，hMSGMSC還具有SOX2和巢蛋白陽性表達，SOX2可以調控成體干細胞的多能性，并且在多種上皮組織中可維持組織穩態[15-16]。提示hMSGMSCs具有未成熟干細胞的特質，具有分化潛能。一項研究發現巢蛋白陽性的細胞在組織受損后可以很快做出反應，進入增殖狀態修復組織的損傷。可見巢蛋白的表達提示hMSGMSCs具有組織儲備干細胞的特征[17]。

綜上，hMSGMSCs在體外培養擴增方面優于hBMSCs,能夠通過較少的小涎腺組織量培養獲得充足的間充質干細胞，并具有與hBMSCs相似的干細胞特性，因此hMSGMSCs將有望成為理想的種子細胞，應用于細胞治療和再生醫學研究中。

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Comparative Study on Proliferative and Adipogenic Ability of Human Minor Salivary Gland Mesenchymal Stem Cells and Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

CAO Rui,YAN Li,ZHANG Chen,SUN Xue-jian,ZHAO Zhen-min
(Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Beijing 100144,China)

Objective To identify the self-renewal and adipogenic differentiation potential and explore ideal seed cells for cell therapy and bioengineered organ, we compared the biological characters including cell proliferation,vitality, apoptosis and adipogenic differentiation ability between human minor salivary gland mesenchymal stem cells (hMSGMSCs) and human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs). Methods hMSGMSCs and hBMSCs derived from 3 patients were isolated and cultured. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sul-fophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt (MTS) assay were used to detect proliferative ability of cells, and the growth curve was plotted according to the absorbance of 490 nm. Cell vitality and apoptosis were measured by MUSE cell analyzer. The adipogenic differentiation of cells was induced for two weeks, and the lipid droplets formation in cells were stained with the Oil Red O and were observed under the microscope, and the optical density at 490 nm (OD490nm) was detected after being dissolved in isopropanol. Results The proliferative ability of hMSGMSCs was higher than hBMSC, and hMSGMSCs could maintain stem cell vitality until the passage 30 (P<0.05). No statistically signif i cant differences of the cell vitality, apoptosis and adipogenic differentiation ability between hMSGMSCs and hBMSCs were found (P>0.05). Conclusion hMSGMSCs has the potential to become one kind of desirable seed cell for basic research and cell therapy in regenerative medicine.

hMSGMSCs;hBMSCs;the cells growth curve;apoptosis;adipogenic differentiation.

Q813.1

A

1008-6455（2017）05-0031-04

2017-01-21

2017-03-28

編輯/張惠娟

趙振民，中國醫學科學院整形外科醫院研究中心，教授，研究方向：整形外科和再生醫學；E-mail:zhaozhenmin0098@vip.sina.com

曹蕊，中國醫學科學院整形外科醫院研究中心，主管技師；研究方向：細胞生物學；E-mail:caorui660428@sina.com