腦脊液PCR檢測對中樞神經系統(tǒng)侵襲性曲霉菌感染的診斷價值
——系統(tǒng)評價和雙變量Meta分析

劉真君，賀光明，董 偉，趙麗麗

腦脊液PCR檢測對中樞神經系統(tǒng)侵襲性曲霉菌感染的診斷價值
——系統(tǒng)評價和雙變量Meta分析

劉真君，賀光明，董 偉，趙麗麗

目的 系統(tǒng)評價腦脊液多聚酶鏈反應(PCR)對中樞神經系統(tǒng)侵襲性曲霉菌感染的診斷價值。方法 計算機檢索PubMed、The Cochrane Library、EMbase、CNKI、WanFang Data、CBM和VIP，查找評估PCR對中樞神經系統(tǒng)侵襲性曲霉菌感染診斷價值的相關研究，檢索時限均為從建庫至2015年1月10日。由兩位評價者按照納入與排除標準獨立篩選文獻、提取資料并評價納入研究的方法學質量后，采用Stata 12.0軟件統(tǒng)計并Meta分析，評估異質性及發(fā)表偏倚。結果 最終納入8個研究，共130例病人，確診/可信病人數(shù)為27例(20.8%)。針對3篇病例對照及1篇隊列研究的Meta分析結果顯示：敏感度(Sen)、特異度(Spe)、陽性似然比(+LR)、陰性似然比(-LR)、診斷比值比(DOR)、ROC曲線下面積(AUC)分別為0.984[95%CI(0.796，0.992 )]、0.930[95% CI(0.837，0.971)]、14.09[95% CI(5.87，33.82)]、0.016[95% CI(0.001，0.843)]、847 [95% CI(16，4536)]、0.99[95% CI(0.97，0.99)]。但有一定的異質性(I2=37%)和發(fā)表偏倚(P=0.095)存在。腦脊液PCR陽性率顯著高于腦脊液GM檢測(P=0.018)和血PCR檢測(P=0.02)。結論 腦脊液PCR對中樞神經系統(tǒng)侵襲性曲霉菌感染有較高的診斷價值。但PCR檢測方法學上存在異質性，發(fā)表偏倚可能高估PCR方法的診斷價值，上述結論仍需謹慎看待。

真菌感染；中樞神經系統(tǒng)；侵襲性曲霉菌；多聚酶鏈反應；系統(tǒng)評價

近年來，隨著器官移植的開展、免疫抑制劑的使用，腫瘤(特別是血液系統(tǒng)腫瘤)發(fā)病率的上升，侵襲性曲霉菌(invasive aspergillosis，IA)導致的死亡有明顯上升的趨勢[1]。 侵襲性曲霉菌主要累及肺和鼻竇，中樞神經系統(tǒng)IA相對較少，但其預后極差，死亡率接近100%[2-3]。在使用伏立康唑后，預后有明顯改善，但死亡率仍為29.2%～69.0%[4-5]。

早期診斷是改善中樞神經系統(tǒng)IA預后的關鍵，目前診斷真菌感染較公認的為EORTC/MSG標準[6]，但其對早期、準確的診斷真菌感染尚有爭議[7]。多聚酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)采用特異性擴增方法能快速、準確檢測出曲霉菌的DNA成分，系統(tǒng)評價表明了PCR方法在血和支氣管肺泡灌洗液中對IA和肺IA有較好的診斷價值[8-9]。本研究探討腦脊液PCR檢測對中樞神經系統(tǒng)IA的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準 納入探討PCR對中樞神經系統(tǒng)IA感染診斷價值的研究，無語種限制。排除標準：①動物實驗及基礎研究；② 重復發(fā)表及重復檢出的文獻。

1.2 檢索策略 計算機檢索PubMed、The Cochrane Library、EMbase、CNKI、WanFang Data、CBM和VIP，檢索時限均為從建庫至2015年1月10日，并檢索納入研究的參考文獻。檢索詞為主題詞和自由詞：聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction)和中樞神經系統(tǒng)真菌感染(central nervous system fungal infections)或曲霉(aspergillosis/aspergillus)。

1.3 文獻篩選、質量評價和資料提取 由兩位研究者根據(jù)納入與排除標準獨立進行文獻篩選，如遇分歧討論解決。文獻質量評價參照QUADAS-2工具[10]。采用自制的資料提取表提取資料，提取內容包括第一作者、研究時間、研究對象、研究設計、金標準、樣本量、TP、FP、FN、TN值，PCR技術和方法。資料不全時通過電子郵件與作者聯(lián)系。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用Stata12.0軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，定量資料的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。Meta分析用Stata的midas模塊，發(fā)表偏倚識別用pubbias選項。計算合并Sen、Spe、+LR、-LR和DOR，并繪制分層綜合受試者操作特征曲線(HSROC，hierarchical summary receiver operating curves)。檢驗水準為α=0.05，雙側檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 文獻檢索結果 初檢出相關文獻61篇，經閱讀摘要及全文，共納入8個研究[11-18]。詳見表1、表2。4篇個案及3篇病例對照研究，1篇隊列研究，共130例病人，確診/可信病人數(shù)為27例(20.8%)。

表1 納入研究特征

表2 PCR技術和方法

2.2 納入研究基本特征及質量評價 4個研究的文獻質量評價參照QUADAS-2工具，QUADAS-2工具從病人選擇、實驗指標(Index test，即待評價的診斷方法)、參考標準(reference standard，即金標準)和流程時間(flow and timing，即是否同步評價診斷方法和金標準，隨訪時間是否合理等)四個區(qū)域，偏倚風險(risk of bias)和適用性(applicability)兩方面評價研究的質量(分為高危、低危和不確定)。詳見表3。Kami 等[12]研究納入已確診病例，未采用盲法評價，有較高的偏倚風險，Badiee等[17]研究納入腦外傷及腦腫瘤病人，適用性方面存在高風險，未報道實驗指標和參考標準是否同步檢測，其偏倚風險和適應性方面不確定。

表3 納入Meta分析研究的質量評價

2.3 Meta分析 將4個研究納入Meta分析，腦脊液PCR用于中樞神經系統(tǒng)曲霉菌感染總的診斷價值：敏感度(Sen)、特異度(Spe)、陽性似然比(+LR)、陰性似然比(-LR)、診斷比值比(DOR)、ROC曲線下面積(AUC)分別為0.984[95%CI(0.796，0.992 )]、0.930[95% CI(0.837，0.971)]、14.09[95% CI(5.87，33.82)]、0.016[95% CI(0.001，0.843)]、847 [95% CI(16，4536)]、0.99[95% CI(0.97，0.99)]。分層綜合受試者操作特征曲線(hierarchical summary receiver operating curves，HSROC)見圖1。

圖1 分層綜合受試者操作特征曲線圖

2.4 與其他檢測方法的比較 多個研究[11，13-14，16-18]比較腦脊液PCR與腦脊液半乳甘露聚糖(GM，galactomannan)檢測，腦脊液PCR和血PCR檢測在中樞神經系統(tǒng)IA感染的診斷價值。在確診/可信中樞神經系統(tǒng)曲霉感染病人中，腦脊液PCR陽性率顯著高于腦脊液GM檢測(16/16和10/16，P=0.018)，腦脊液PCR陽性率顯著高于血PCR檢測(9/10和3/10，P=0.02)。

2.5 異質性分析 異質性檢驗Q=0.835(P=0.329)，I2=37%，提示有一定的異質性。各研究主要為血液疾病病人，年齡[12，16-17][38(四分位間距38，50) 對37.5(12，63) 對25.5(7，39)]和性別構成(男/女，3/2 對 2/4 對 7/3)無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各研究的中樞神經系統(tǒng)病變類型(孤立腦膿腫/多發(fā)腦膿腫/出血性梗死，1/2/2 對 3/3/0 對 1/4/0)，原發(fā)或繼發(fā)中樞神經系統(tǒng)IA(0/5 對 3/3 對 3/11)無統(tǒng)計學意義(P>0.05)[12，16，18]。

8個研究的PCR技術方法存在一定的異質性。腦脊液樣本量(報道為1 mL～2 mL)，DNA提取方法(離心或非離心，主要使用酶消化法和酚-氯仿提取)，引物設計(主要為煙曲霉18s rRNA基因)，DNA擴增方法(標準、巢式或實時定量PCR)，是否有對照(陰性或陽性對照)等不同研究間有差異，但由于研究較少，難以做亞組及敏感性分析。Hummel 等[16]的研究比較了巢式PCR和實時定量PCR，發(fā)現(xiàn)巢式PCR有更高的敏感性。

2.6 發(fā)表偏倚的識別 發(fā)表偏倚檢驗的t值為-3.01(95%CI-49.90，8.85)，P=0.095，提示可能有發(fā)表偏倚存在。

3 討 論

EORTC/MSG診斷標準結合了宿主因素，臨床表現(xiàn)和真菌學依據(jù)，診斷分為確診(proven，無菌部位的顯微鏡分析或培養(yǎng))，臨床診斷/可信(probable，非無菌部位有真菌學依據(jù)，包括痰液、尿液等顯微鏡分析或培養(yǎng)直接證據(jù)，葡聚糖DG /和半乳甘露聚糖抗原GM檢測等間接證據(jù))，擬診(possible，僅有宿主因素，臨床表現(xiàn)或影像學表現(xiàn))。但針對IA感染的病人，臨床和影像學表現(xiàn)缺乏特異性，培養(yǎng)陽性率極低，針對擬診的高危病人，臨床上采用了經驗性治療方案，但增加了抗真菌藥物不必要的使用，造成醫(yī)療資源的浪費和藥物不良反應的增加。分子水平的診斷方法(曲霉抗原和DNA)能將擬診提升到可信，避免上述問題的發(fā)生，但血DG 和GM實驗的敏感性有限，有部分假陽性[19]。并且，有研究表明IA感染的病人中，血PCR陽性較GM陽性早68 d[20]，提示PCR較其他方法更有早期診斷的價值。

傳統(tǒng)的SROC(summary ROC)模型用于診斷試驗的Meta分析有較多的方法學問題，如受到閾值效應的影響，沒有考慮研究估計值的準確度，不能估計研究間的異質性，回歸中解釋變量測量錯誤，導致置信區(qū)間和P值的偏移[21]。本研究采用了雙變量隨機效應模型和HSROC模型，其估計了平均敏感度、特異度和受試點，估計了參數(shù)中不能解釋的變量及其相關性。本研究表明，腦脊液PCR檢測方法對中樞神經系統(tǒng)IA有較高的診斷價值，綜合敏感度和特異度為0.984和0.930。陽性預測值>10和陰性預測值<0.1通常認為可以確立和排除診斷[22]，PCR方法的綜合+LR和-LR分別為 14.09和0.016，可用于肯定或否定中樞神經系統(tǒng)IA的診斷。

本研究表明對中樞神經系統(tǒng)IA的診斷，腦脊液的PCR優(yōu)于血PCR檢測和腦脊液GM檢測。既往研究表明針對肺部IA，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fliud，BAL)的GM檢測診斷價值優(yōu)于血清GM檢測[23]，BAL的PCR檢測診斷表現(xiàn)與BAL的GM檢測相似或略優(yōu)[24-25]。對早期肺部IA，BAL的PCR檢測陽性，而血的PCR檢測為陰性[26]。提示局部IA感染，感染部位的抗原/DNA檢測可能更有早期診斷的價值。

本研究的局限性：①納入研究的總體質量和樣本量不足，可能有發(fā)表偏倚的存在。但由于中樞神經系統(tǒng)IA低的發(fā)病率和臨床識別困難，開展大樣本、前瞻性研究可行性較困難，系統(tǒng)評價和Meta分析的目的就是全面收集相關研究，提高總的樣本量和統(tǒng)計效能，減少抽樣誤差，進一步說明了本研究的必要性。②PCR的技術和方法上各研究間有較大的差異性。實際上，PCR方法的標準化問題是其未能進入EORTC/MSG診斷標準的主要原因。研究表明，針對全血PCR方法的敏感性與DNA提取方式(使用bead beating，增加的樣本量和減少稀釋液量)和內對照(排除假陰性)正相關，與DNA的擴增方式無關[27]，針對血漿PCR方法標準化步驟減少(沒有白細胞DNA的干擾)，其敏感性與DNA提取方法、靶位點為真菌的內轉錄間隔區(qū)(ITS，internal transcribed spacer )、內對照正相關[28]。但目前沒有針對腦脊液DNA方法標準化的相關研究。

PCR方法對中樞神經系統(tǒng)IA有較高的診斷價值，但對非血液疾病病人(ICU或實體器官移植)的診斷價值，以PCR診斷方法為基礎的治療能否改善病人的預后，PCR診斷方法的污染和標準化等方面還需要更多的研究。

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(本文編輯王雅潔)

Diagnostic Value of Cerebrospinal Fluid PCR Detection for Invasive Aspergillosis in the Central Nervous System：Systematic Review and Bivariate Meta-analysis

Liu Zhenjun，He Guangming，Dong Wei，Zhao Lili

Sichuan Cancer Hospital，Chengdu 610041，Sichuan，China

Objective Systematic review about diagnostic value of cerebrospinal fluid PCR detection for invasive aspergillosis in the central nervous system (CNS).Methods Computer retrieval of PubMed，The Cochrane Library，EMbase，CNKI，Wan Fang Data，CBM and VIP was conducted.Studies published from initiation of the databases until January 10，2015，assessing diagnostic performance of CSF PCR detection for invasive aspergillosis in the central nervous system were searched.Two reviewers independently searched literature on the grounds of inclusion and exclusion standards，extracted information and evaluated methodological quality of included studies.statistical calculation and meta-analysis were conducted via Stata 12.0 software and heterogeneity and publication bias were assessed.Results Totally eight studies were enrolled，with proven/probable 27 cases (20.8%) in 130 patients.Meta-analysis based on 3 case-control studies and 1 cohort study showed：sensitivity (Sen)，specific (Spe)，positive likelihood ratio (+ LR)，negative likelihood ratio (-LR) and diagnostic odds ratio (DOR)，the area under the ROC curve (AUC) were 0.984 [95% CI(0.796，0.992)]，0.930 [95% CI(0.837，0.971)]，14.09 [95% CI(5.87，33.82)]，0.016 [95% CI(0.001，0.843)] and 847 [95% CI(16,453 6)]，0.99 [95% CI(0.97，0.99)]，respectively.But there were moderate heterogeneity (I2= 37%)and publication bias (P=0.095).PCR positive rate in CSF was significantly higher than that of GM test in CSF(P=0.018) and blood PCR detection (P=0.02).Conclusion PCR test in CSF for invasive aspergillosis of the central nervous system has high diagnostic value.However，due to methodological heterogeneity of PCR detection and possibly overestimated diagnostic performance of PCR by publication bias，aforementioned conclusion must be drawn conscientiously.

fungal infection；central nervous system；invasive aspergillosis；polymerase chain reaction；systematie review

四川省腫瘤醫(yī)院(成都 610041)，E-mail：lantianboyun@163.com

引用信息：劉真君，賀光明，董偉，等.腦脊液PCR檢測對中樞神經系統(tǒng)侵襲性曲霉菌感染的診斷價值：系統(tǒng)評價和雙變量Meta分析[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(9)：1041-1045.

R473 R255

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.09.007

1672-1349(2017)09-1041-05

2016-02-22)