俞氏灌腸方對潰瘍性結腸炎大鼠腫瘤壞死因子及白細胞介素的影響*

葉 彬 來麗群

浙江省杭州市中醫院 浙江 杭州 310007

實驗研究

俞氏灌腸方對潰瘍性結腸炎大鼠腫瘤壞死因子及白細胞介素的影響*

葉 彬 來麗群

浙江省杭州市中醫院 浙江 杭州 310007

目的：觀察俞氏灌腸方對潰瘍性結腸炎模型大鼠的治療作用以及對腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-2（IL-2）和白介素-10（IL-10）的影響。方法：48只SD大鼠隨機分成俞氏灌腸方原劑量組、低劑量組、美沙拉嗪組、模型組各10只，空白對照組8只。予以三硝基苯磺酸建立模型后，分組灌腸給藥2周后處死。觀察其結腸組織學改變情況，并測定其血清TNF-α、IL-2、IL-10的含量。結果：①俞氏灌腸方原劑量組、低劑量組、美沙拉嗪組治療后疾病活動指數（DAI）評分與模型組相比明顯下降(P＜0.01)，且原劑量組評分下降較其他2組更為明顯(P＜0.01)。②3個治療組大鼠的組織學評分較模型組明顯降低(P＜0.01)。③3個治療組與模型組相比，血清TNF-α均有明顯的降低(P＜0.01)，IL-2、IL-10有明顯的升高(P＜0.01)；原劑量組血清IL-2升高更為明顯(P＜0.01)。結論：俞氏灌腸方能有效緩解潰瘍性結腸炎模型大鼠的腸道炎癥，治療作用與藥物的濃度相關，其主要的優勢在于能有效的提高IL-2水平。

俞氏灌腸方 潰瘍性結腸炎 腫瘤壞死因子 白細胞介素 實驗研究

潰瘍性結腸炎(UC)是以侵犯大腸黏膜與黏膜下層為主的炎癥性腸病，較容易出現遷延不愈或反復發作等情況。有研究表明，在過去20年內，我國UC的發病率增高了6倍[1]。故研究其發病機理，改善治療方法，提高治療效果十分必要。本研究觀察全國老中醫藥專家學術經驗繼承工作指導老師俞尚德的經驗方俞氏灌腸方對三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的大鼠UC模型的治療作用及對腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-2（IL-2）和白介素-10（IL-10）的影響，以期系統、規范評價和確證俞氏灌腸方的療效，部分揭示其治療UC的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物：選擇健康的SD大鼠48只，6周齡，體重120±20g，雌雄各半。由浙江省動物實驗中心提供。隨機分為5組，其中俞氏灌腸方原劑量組（以下簡稱原劑量組）、俞氏灌腸方低劑量組（以下簡稱低劑量組）、美沙拉嗪組、模型組，每組10只，正常對照組8只。

1.2 實驗藥物及試劑:5%三硝基苯磺酸（TNBS）購自浙江達文生物醫藥有限公司；俞氏灌腸方藥物組成:蒲公英、黃芩、敗醬草、紅藤、丹參各30g，半邊蓮、半枝蓮、生薏仁各20g，由杭州市中醫院藥劑科提供，并由制劑中心制備濃縮成1.05g/ml的滅菌原液。美沙拉嗪顆粒劑購自博福益普生（天津）制藥有限公司，將1000mg顆粒劑磨成粉后，用滅菌蒸餾水溶解后稀釋配制成5mg/ml的混懸液待用。大鼠IL-2，IL-10，TNF-α酶聯免疫檢測試劑盒購自R&D公司；水合氯醛、無水乙醇等購自杭州市中醫院藥劑科。

1.3 主要實驗儀器:37℃恒溫箱，微量移液器，京君龍實驗儀器北京有限公司；全自動酶標儀（Bio-Tek ELX800）Bio-Tek，美國；低溫離心機（3-18KS）Sigma，德國，切片機（RM2015），萊卡，德國；萊卡病理成像系統，LEICA，德國；BM-H型病理組織包埋機，安徽電子科學研究所；顯微鏡（BX51T-PHD-J11)，奧林巴斯，日本。

2 實驗方法

2.1 UC大鼠模型的建立：動物分籠飼養，標準顆粒飼料，室溫20±2℃，濕度40%～60%，光暗周期各12h環境飼養。造模采用較為常用的三硝基苯磺酸（TNBS）與乙醇聯合誘導建立UC大鼠模型的方法[2]。3天后大鼠內出現腹瀉、黏液膿血便后，證實造模成功。

2.2 分組給藥方法:空白組正常喂養，模型組每天予以生理鹽水0.4ml灌腸，原劑量組予以實驗藥物0.4ml灌腸，每日劑量為3.5g/kg；低劑量組以每日1.75g/kg的劑量灌腸；美沙拉嗪組則予以美沙拉嗪混懸液0.4ml灌腸，每日劑量為16.7mg/kg。

2.3 疾病活動指數(DAI)觀察：每天大便性狀、飲食、活動等情況，并應用聯苯胺直接棉棒法晨測便潛血1次。對所有小鼠進行體重下降、大便性狀、血便3方面的評分，評分標準為疾病活動指數(DAI)[3]。

2.4 動物標本的取材:于給藥第2周末先腹腔注射水合氯醛麻醉后，剪開腹腔，于腹腔靜脈處抽取靜脈血2ml，分離出血清，-80℃保存。留取距肛2cm左右的結腸標本，觀察形態，存于4%甲醛固定，送病理檢測，對所有切片的病理組織學改變評分[4]。

2.5 統計學方法:應用SPSS13.0統計軟件進行統計分析。

3 實驗結果

3.1 DAI評分:見表1。

表1 各組大鼠給藥后DAI評分結果(±s，分)

表1 各組大鼠給藥后DAI評分結果(±s，分)

注:與模型組比較，*P＜0.01；與原劑量組比較，#P＜0.01。

藥后2周末0* 1.37±0.29 0.87±0.31*0.68±0.17*0.94±0.19*組別空白組模型組美沙拉嗪組原劑量組低劑量組只數8 10 10 10 10第3天0.37±0.16*2.20±0.76 1.97±0.56 2.09±0.49 2.13±0.32藥后1周末0.13±0.08*2.17±0.77 1.23±0.33*#0.96±0.37*#1.52±0.42*#

3.2 結腸組織病理學觀察:光鏡下觀察模型組組織學評分明顯高于其他組（P＜0.01）；3個藥物治療組未見明顯的潰瘍及糜爛，低劑量組及美沙拉嗪組有少量的炎性細胞侵潤，3組間比較無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠組織學評分結果(±s，分)

表2 各組大鼠組織學評分結果(±s，分)

注:與模型組比較，*P＜0.01。

組別空白組模型組美沙拉嗪組原劑量組低劑量組只數8 10 10 10 10組織學評分0.46±0.23*11.27±2.25 4.32±2.43*3.79±0.95*4.48±1.63*

3.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-2、IL-10水平:使用ELISA試劑盒測各組血清中TNF-α、IL-2、IL-10的含量。與模型組比較，各治療組的血清TNF-α均有明顯的下降，血清IL-2、IL-10有明顯上升（P＜0.01）；原劑量組血清IL-2升高較劑量組及美沙拉嗪組更為顯著（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-2、IL-10水平(±s)

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-2、IL-10水平(±s)

注:與模型組比較，*P＜0.01；與原劑量組比較，#P＜0.01。

組別空白組模型組美沙拉嗪組原劑量組低劑量組IL-10（pg/ml）42.7875±2.3666*29.5050±1.6745 35.6230±1.4176*36.7340±1.6425*32.9010±1.5968*只數8 10 10 10 10 TNF-α（ng/L）123.0925±6.1408*194.8680±9.3208 162.0880±5.6380*167.2370±7.6618*177.4660±4.6110*IL-2（ng/L）291.1488±10.4470*182.5520± 9.9620 237.8190±12.1858*#257.4040±11.5020*225.7950± 9.6816*#

4 討論

關于潰瘍性結腸炎的發病機制，近年來對免疫異常和炎性遞質學說較為重視。目前根據細胞因子在炎癥反應中所起的作用，將其分為兩類，即促炎性細胞因子（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等）和抗炎性細胞因子（IL-2、IL-4、IL-10和TGF-β等）。腸道炎癥的啟動與進展，與這兩組因子間的平衡失調有關[5]。

潰瘍性結腸炎屬于中醫學中“泄瀉”“痢疾”“便血”“腸風”等范疇[6]。本病的病機為濕熱久稽，蘊結大腸，熱入營血，大腸血絡受損。俞氏灌腸方中蒲公英清熱解毒，為君藥；黃芩、敗醬草清瘀排膿為臣藥；半枝蓮、半邊蓮消腫解毒，生薏仁化濕健脾，紅藤、丹參活血通絡共為佐藥。諸藥合用共奏清熱解毒、消腫散瘀、祛濕化濁之功效。

本實驗結果顯示，俞氏灌腸方原劑量組UC大鼠的一般狀況、結腸表現及病理表現比模型組有明顯的改善，其癥狀改善的速度較低劑量組及美沙拉嗪組有明顯的優勢；且原劑量組大鼠TNF-a水平明顯下降，IL-2、IL-10的水平有明顯升高，上調IL-2的作用較為顯著。上述結果說明，俞氏灌腸方能迅速的減輕UC的癥狀，減少腸道炎癥，促進潰瘍愈合，其作用程度與藥物的濃度相關，其作用機理與調節細胞因子間的平衡有關。與美沙拉嗪相比較，其主要的優勢在于提高IL-2的水平。

[1]Chow DK，Leonq RW,Tsoi KK．Long-term follow-up of ulcerative colitis in the Chinese population[J]．Am J Gastroenter,2009,104(3):647-654．

[2]葛翠翠，王慧娜,杜麗欣，等.炎癥性腸病小鼠模型的建立及其影響因素探討［J］.生物技術通訊，2013，24（4）:514-518.

[3]Murano M，Maemura K，Hirata I，et al.Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappa B(p65)antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium(DSS)-induced colitis[J]. Clin Exp Immuno，2000，120(1):51-58.

[4]Ekstrom GM．Oxazolone-induced colitis in rats:effects of budesonide，cyclosporine A，and 5-aminosalicylic acid[J].Scand J Gastroenterol，1998，33(2):174-179.

[5]樊慧麗，陳玉梅.潰瘍性結腸炎的發病機制和治療進展[J].中國全科醫學.2012,15(2):228-230.

[6]孫利麗.近5年中醫治療潰瘍性結腸炎組方用藥規律分析[J].浙江中醫雜志,2013,48(5):382-383.

2016-09-22

浙江省中醫藥科技計劃項目基于細胞因子網絡探討俞氏灌腸方灌腸對潰瘍性結腸炎大鼠模型的影響，編號：2013ZA092