木賊藥材HPLC指紋圖譜及質量評價研究*

汪 霞劉兵兵張慶英姚 沖

1 浙江省長興縣中醫院 浙江 長興 313100 2 山東省聊城職業技術學院 山東 聊城 252000 3 浙江省湖州市中心醫院 浙江 湖州 313000

中藥研究

木賊藥材HPLC指紋圖譜及質量評價研究*

汪 霞1劉兵兵1張慶英2姚 沖3#

1 浙江省長興縣中醫院 浙江 長興 313100 2 山東省聊城職業技術學院 山東 聊城 252000 3 浙江省湖州市中心醫院 浙江 湖州 313000

木賊 指紋圖譜 高效液相色譜 質量評價

木賊藥材為木賊科植物木賊的干燥地上部分。目前，藥典收載正品木賊有1種，常見混淆品種有問荊、筆管草、節節草[1-2]。本文對市面上銷售的10批木賊藥材樣品進行指紋圖譜研究，并建立了相應木賊藥材HPLC指紋圖譜評價方法，為評價藥材質量提供可靠實驗依據。

1 試藥與儀器

1.1 試藥:供含量測定用的對照品山柰素（中國食品藥品檢定研究院，批號:110861-201310）、山柰酚-3，7-雙葡萄糖苷、山柰酚-3-雙葡萄糖-7-葡萄糖苷、山柰酚-3-雙葡萄糖苷（自制，其化學結構經MS，1H-NMR，13C-NMR和DEPT譜確證，面積歸一化法檢測純度大于98%）。甲醇、乙腈均為色譜純，美國Dima公司；冰醋酸、磷酸均為分析純；水為自制純凈水。木賊藥材經長興縣中醫院郭小元中藥師鑒定其原植物為木賊科木賊的干燥地上部分，藥材來源及產地見表1。

表1 木賊藥材樣品來源

1.2 儀器:惠普1100型高效液相色譜儀，配有四元梯度泵，在線脫氣機，柱溫箱，二級管陳列檢測器；CP225D型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；KQ5200B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件:色譜柱:YMC-Pack ODS-A（150mm× 4.6mm，5μm）；流動相:甲醇（A）0.5%冰醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5min，0%A；5～20min，0%→20%A；20～30min，20%A；30～55min，20%→70%A）；流速:0.8ml/min；檢測波長:295nm；柱溫:35℃；進樣量:10μL。理論板數按山柰素峰計算應不低于3000。

2.2 混合對照品溶液的制備:取山柰酚-3，7-雙葡萄糖苷、山柰酚-3-雙葡萄糖-7-葡萄糖苷、山柰酚-3-雙葡萄糖苷和山柰素對照品適量，精密稱定，用50%甲醇超聲溶解，配置成濃度分別為 27.95，45.22，32.12，56.95μg/mL的混合對照溶液。

2.3 供試品溶液的制備:取木賊樣品粗粉0.2g，煎煮2次，每次加水800ml，第1次2小時，第2次1小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至約50ml，放冷，加入乙醇使含醇量達70%，放置36小時，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，放冷，加入乙醇使含醇量達80%，放置36小時，濾過，用40%氫氧化鈉溶液調節PH值至8.0，放置36小時，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，冷藏36小時，加入活性炭，在110℃加熱40分鐘，放冷至室溫，濾過，濾液置50ml量瓶中，加流動相溶液至刻度，搖勻，再用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學考察:分述如下。

2.4.1 精密度試驗:精密稱取木賊藥材(編號S2) 0.2g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖峰面積及保留時間，結果表明其相對峰面積的RSD為0.23%，各色譜峰相對保留時間的RSD為0.16%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗:精密稱取木賊藥材(編號S2) 0.2g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別在0、1、2、4、6、8、12、24h進樣，考察供試品溶液的穩定性。結果表明，各色譜峰相對保留時間的RSD為1.02%，各色譜峰的相對峰面積的RSD為2.3%，表明處理后的供試品溶液在24h內基本穩定。

2.4.3 重復性試驗:精密稱取木賊藥材(編號S2)0.2g共6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，考察方法的重復性。結果表明其相對峰面積的RSD為1.3%，各色譜峰相對保留時間的RSD為2.8%，表明該方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜的建立:指紋圖譜及共有峰的標定取自不同來源的10批次木賊藥材，按“2.3”方法制備供試品溶液，照“2.1”條件進行測定分析。通過比較各批次藥材色譜圖，確定22個特征峰，將HPLC色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系2004A版》軟件，建立木賊藥材指紋圖譜。將化學信息較多的S1號樣品設為典型色譜圖，與混合對照品圖譜對照，指認其中4個色譜峰，分別為山柰酚-3，7-雙葡萄糖苷（9號峰）、山柰酚-3-雙葡萄糖-7-葡萄糖苷（11號峰）、山柰酚-3-雙葡萄糖苷（13號峰）和山柰素（21號峰），在各批次樣品圖譜中山柰酚-3，7-雙葡萄糖苷的色譜峰分離良好，峰面積較大且為所有樣品共有，所以確定9號峰為參比峰。

2.6 相似度評價:采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》對10批木賊樣品的HPLC指紋圖譜進行相似度評價，S1～S10木賊樣品相似度評價結果分別為0.982、0.963、0.954、0.953、0.963、0.959、0.968、0.986、0.978、0.971，分析結果顯示10批木賊相似度均在0.950以上，表明各產地木賊具有較高的相似度。

2.7 化學模式識別:分述如下。

2.7.1 系統聚類分析:將各色譜峰相對于內參比色譜峰的峰面積量化，運用SPSS統計分析軟件對其進行系統聚類分析，采用歐氏距離作為樣品的測度，見圖1。根據圖3可以看出10批木賊藥材可以分為三大類，S2、S4、S5、S6聚為一類，S1、S7聚為一類，其余聚為一類。參照樣品產地，S2、S4、S5、S6的產地集中在東北地區。

圖1 木賊樣品聚類分析結果

2.7.2 主成分分析:10批木賊藥材樣品經上述實驗獲得各批樣品的色譜數據，HPLC圖譜各共有峰的峰面積相對藥材稱樣量之比，即單位質量藥材峰面積進行量化，得到10×22階的數據矩陣，采用SPSS軟件對矩陣進行分析，以主成分PC1和PC2所組成的維投影圖見圖2。10批木賊樣品分組結果與聚類分析結果相一致。

圖2 主成分分析平面投影圖

3 討論

目前，2010版《中國藥典》對于木賊的含量測定是將木賊甲醇提取物進行酸水解，以苷元山柰素作為對照品。文獻報道的木賊成分測定方法多以苷元山柰素為指標性成分[3-4]，而以黃酮苷作為木賊的質量評價指標的研究報道不多[5]。本實驗采用以水溶性苷類成分為主的木賊藥材指紋圖譜方法，從活性成分和“活性物質群”角度來評價木賊品質優劣。研究結果顯示梯度洗脫分析耗時短，并且22個特征成分獲得較好的分離度，且酸性緩沖體系可明顯改善具有弱酸性酚羥基的黃酮醇類成分的分離效果和峰形。另外，研究還發現在295nm處指紋圖譜色譜峰具有良好峰形，且基線平穩，因此選用295nm作為木賊指紋圖譜的檢測波長。本實驗表明10批木賊藥材的化學成分組成較一致，批次間各成分種類高度相似而含量的有一定差異。聚類分析結果表明于不同地方購買的藥材其產地可能相近或相同，這也與主成分分析分組相一致，應用系統聚類分析和主成分分析2種化學計量學方法對木賊色譜積分數據進行了模式識別的探討，兩者判斷結果基本一致。

[1]劉振啟，劉杰.木賊與混亂品的鑒別[J].首都食品與醫藥，2015，22(13):55.

[2]張浩，張舒娜，邵財，等.木賊科木賊與節節草不同居群形態多樣性分析[J].吉林中醫藥，2015，35(7):707-709.

[3]張憲，趙惠萍，張小茜，等.木賊質量標準的研究[J].中國中醫藥信息雜志，2005，12(5):48-50.

[4]酈紅巖，湯小偉，周堅祥，等.HPLC法測定木賊中槲皮素和山柰素的含量[J].藥學研究，2012，31(7):400-401.

[5]趙磊，李沖，張承忠，等.木賊中三種黃酮苷的含量測定[J].中國現代應用藥學，2005，22(2):159-161.

2016-06-13

浙江省中西醫結合學會臨床藥學科研專項基金項目基于RWS的丹參多酚酸鹽臨床使用情況及安全性評價，編號：2013LYSX015；浙江省藥學會醫院藥學科研專項基金項目基于RWS的丹參多酚酸鹽基層醫院用藥評價與分析，編號：2013ZYY17

# 通訊作者：姚 沖，E-mail：hzszxyy@foxmail.com